पीटर सरनो, स्टॅनफोर्ड युनिव्हर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन, स्टॅनफोर्ड युनिव्हर्सिटी, कॅलिफोर्निया यांनी संपादित केले, 25 डिसेंबर 2020 रोजी मंजूर (25 ऑक्टोबर 2020 रोजी पुनरावलोकन केले)
आम्ही कोरोनाव्हायरस-ट्रान्सक्रिप्शन कॉम्प्लेक्सच्या प्रतिकृतीमधील सबयुनिट्समधील परस्परसंवादाचा अहवाल देतो, जे प्रतिकृती आणि उत्क्रांती संवर्धनासाठी आवश्यक आहेत.nsp12 शी संबंधित NiRAN डोमेन ट्रान्समध्ये न्यूक्लिओसाइड मोनोफॉस्फेट (NMP) ट्रान्सफरेज क्रियाकलाप असल्याचा पुरावा आम्ही प्रदान केला आणि त्याचे लक्ष्य म्हणून nsp9 (एक आरएनए बंधनकारक प्रोटीन) ओळखले.NiRAN Mn2+ आयन आणि समीप संरक्षित Asn अवशेषांवर अवलंबून असलेल्या प्रतिक्रियेमध्ये संरक्षित एनएसपी9 एमिनो टर्मिनसला एनएमपी मोआइटीचे सहसंयोजक संलग्नक उत्प्रेरित करते.असे आढळून आले की NiRAN क्रियाकलाप आणि nsp9 NMPylation कोरोनाव्हायरस प्रतिकृतीसाठी आवश्यक आहेत.डेटा आम्हाला नेस्टेड व्हायरस एन्झाईम मार्करच्‍या या क्रियाकलापाचा संबंध आरएनए व्हायरसच्या वर्गात आरएनए संश्लेषणाची सुरुवात कार्यशील आणि उत्क्रांती दृष्‍टीने सुसंगत असल्‍याच्‍या गृहीतकातील मागील निरिक्षणांशी जोडण्‍याची अनुमती देते.
Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae आणि 12 इतर कुटुंबे) चे RNA-आश्रित RNA पॉलिमरेझ (RdRps) पॉलीप्रोटीनमधून बाहेर पडलेल्या नॉन-स्ट्रक्चरल प्रोटीन (nsp) मध्ये अमिनो-टर्मिनल (N-टर्मिनल) डोमेनशी जोडलेले आहे, ज्याला NiRAN म्हणतात. 1ab हे व्हायरल मेन प्रोटीज (Mpro) चे बनलेले आहे.पूर्वी, धमनी विषाणू NiRAN-RdRp nsp ची स्वतःची GMPylation/UMPylation क्रियाकलाप नोंदविला गेला होता, आणि (सध्या अज्ञात) व्हायरस आणि/किंवा सेल बायोपॉलिमरायझेशन थिंग्जमध्ये न्यूक्लिओसाइड मोनोफॉस्फेट (NMP) च्या हस्तांतरणासाठी एक क्षणिक निर्माण करण्यास सुचवले होते.येथे, आम्ही दाखवतो की कोरोनाव्हायरस (मानवी कोरोनाव्हायरस [HCoV]-229E आणि गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनाव्हायरस 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) मध्ये Mn2+-आश्रित NMPylation क्रियाकलाप आहे, जो Mpro-मध्यस्थ nsp9 च्या निर्मितीद्वारे nsp9 पासून प्राप्त होतो. एन-टर्मिनल फ्लॅंकिंग एनएसपीएस प्रोटीओलिटिकली सोडले जाते, फॉस्फोरामीडेट एनएसपी9 च्या एन-टर्मिनलवर प्राथमिक अमाईन (N3825) ला जोडलेले असते.युरिडाइन ट्रायफॉस्फेट हे या अभिक्रियामध्ये प्राधान्य दिलेले न्यूक्लियोटाइड आहे, परंतु एडेनोसिन ट्रायफॉस्फेट, ग्वानोसिन ट्रायफॉस्फेट आणि सायटीडाइन ट्रायफॉस्फेट देखील योग्य सह-सबस्ट्रेट आहेत.रीकॉम्बीनंट कोरोनाव्हायरस nsp9 आणि nsp12 प्रथिने आणि अनुवांशिकरित्या इंजिनिअर केलेल्या HCoV-229E उत्परिवर्तींचा वापर करून उत्परिवर्तन अभ्यासांनी NiRAN-मध्यस्थ nsp9 NMPylation आणि सेल संस्कृतीमध्ये व्हायरस प्रतिकृतीसाठी आवश्यक अवशेष निर्धारित केले.डेटाने NiRAN सक्रिय साइट अवशेषांच्या अंदाजाची पुष्टी केली आणि nsp9 NMPylation मध्ये nsp9 N3826 अवशेषांची महत्त्वपूर्ण भूमिका आणि विट्रोमध्ये व्हायरस प्रतिकृती निर्धारित केली.हे अवशेष संरक्षित एन-टर्मिनल NNE ट्रायपेप्टाइड अनुक्रमाचा भाग आहे आणि कोरोनाव्हायरस कुटुंबातील nsp9 आणि त्याचे होमोलॉगचे एकमेव अपरिवर्तनीय अवशेष असल्याचे सिद्ध झाले आहे.हा अभ्यास इतर नेस्टेड व्हायरसच्या NMPylation क्रियाकलापाच्या कार्यात्मक अभ्यासासाठी एक भक्कम पाया प्रदान करतो आणि अँटीव्हायरल औषधांच्या विकासासाठी संभाव्य लक्ष्ये प्रस्तावित करतो.
निडोवायरेल्स पॉझिटिव्ह-स्ट्रँडेड आरएनए विषाणू विविध पृष्ठवंशी आणि अपृष्ठवंशी प्राण्यांना संक्रमित करतात (1, 2).ऑर्डरमध्ये सध्या 14 कुटुंबांचा समावेश आहे (3), ज्यापैकी कोरोनाव्हायरस कुटुंबाचा गेल्या 20 वर्षांमध्ये विस्तृतपणे अभ्यास केला गेला आहे.त्या वेळी, प्राण्यांच्या यजमानांमधून तीन झुनोटिक कोरोनाव्हायरस उद्भवले आणि मानवांमध्ये तीव्र श्वसन संक्रमणाचा मोठ्या प्रमाणात उद्रेक झाला.गंभीर तीव्र संसर्गजन्य रोगांमुळे होणार्‍या सततच्या साथीच्या रोगांसह.रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोनाव्हायरस 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).निडोव्हायरस एक सामान्य जीनोम संघटना सामायिक करतात आणि झिल्ली-बाउंड प्रतिकृती-प्रतिलेखन कॉम्प्लेक्स (RTC) चे सबयुनिट 5-?²-टर्मिनल दोन-तृतियांश आणि व्हायरस कणांचे मुख्य संरचनात्मक उपयुनिट तसेच काही उपकरणे मध्ये एन्कोड केलेले आहेत. .प्रथिने, जीनोमच्या 3??² शेवटच्या तिसऱ्या (1) मध्ये एन्कोड केलेले.प्लॅनेरियन व्हायरस (मोनोविरिडे) (8) च्या एका कुटुंबाशिवाय, सर्व नेस्टेड व्हायरस दोन मोठ्या ओपन रीडिंग फ्रेम्स (ORF) ORF1a आणि ORF1b मध्ये आरटीसी सबयुनिट्स एन्कोड करतात, ज्याचे जीनोमिक आरएनए मधून भाषांतर केले जाते.ORF1a पॉलीप्रोटीन (pp) 1a एन्कोड करते आणि ORF1a आणि ORF1b संयुक्तपणे pp1ab एन्कोड करते.ORF1a द्वारे एन्कोड केलेल्या मुख्य प्रोटीज (Mpro) च्या सामान्य सहभागासह, pp1a आणि pp1ab दोन्ही प्रोटीओलॅटिक पद्धतीने विविध नॉन-स्ट्रक्चरल प्रोटीन्स (nsps) मध्ये प्रक्रिया केली जातात, ज्याला 3CLpro म्हणूनही ओळखले जाते, कारण त्यात picornavirus (3Cpro) च्या समरूपता आहे. 9).हे nsps एका मोठ्या डायनॅमिक RTC मध्ये एकत्र केले जातात, जीनोमिक RNA (प्रतिकृती) आणि सबजेनोमिक RNA (ट्रान्सक्रिप्शन) च्या संचाचे संश्लेषण उत्प्रेरित करतात आणि ORF1b (10% ? ?12).
कोर RTC मध्ये RNA-आश्रित RNA पॉलिमरेज (RdRp) (13), सुपरफॅमिली 1 हेलिकेस (HEL1) (14, 15) आणि अनेक RNA प्रोसेसिंग एन्झाइम समाविष्ट आहेत, जे मुख्यत्वे ORF1b मध्ये एन्कोड केलेले आहेत आणि कोरोनाव्हायरस कुटुंबात त्यात nsp12-nsp16 आणि समाविष्ट आहेत. nsp9-nsp12 Arterioviridae कुटुंबातील (संदर्भ 10ââ 12 पहा).RdRp आणि HEL1 हे पक्ष्यांच्या घरट्याच्या विषाणूच्या दोन (एक-पाचव्या) संरक्षित डोमेनचे प्रतिनिधित्व करतात आणि इतर आरएनए विषाणूंमध्ये समरूपता असते.कोर प्रतिकृतीला pp1a च्या कार्बोक्सी-टर्मिनल (C-टर्मिनल) क्षेत्रातून सोडलेल्या अनेक लहान nsps, Mpro (अनुक्रमे कोरोनाव्हायरस nsp5 आणि धमनी व्हायरस nsp4) च्या डाउनस्ट्रीमसह इतर सबयुनिट्सद्वारे मदत केली जाते असे मानले जाते.त्यांच्याकडे मर्यादित कौटुंबिक-विशिष्ट संरक्षण आणि विविध क्रियाकलाप आहेत (संदर्भ 10ââ12 मध्ये पुनरावलोकन केले आहे).
तुलनेने अलीकडे, सर्व नेस्टेड व्हायरसमध्ये RdRp च्या शेजारील एमिनो टर्मिनस (N-टर्मिनस) येथे अद्वितीय अनुक्रम स्वरूप वैशिष्ट्यांसह एक डोमेन आढळले, परंतु इतर कोणतेही RNA व्हायरस नाहीत (16).त्याचे स्थान आणि न्यूक्लियोटाइड ट्रान्सफरेज (न्यूक्लियोसाइड मोनोफॉस्फेट [NMP] ट्रान्सफरेज) क्रियाकलापावर आधारित, या डोमेनचे नाव NiRAN (Nestvirus RdRp-संबंधित न्यूक्लियोटाइड ट्रान्सफरेज) आहे.NiRAN-RdRp चे दुहेरी-डोमेन कॉम्बिनेशन कोरोनाविरिडे कुटुंबात nsp12 आणि Arterioviridae कुटुंबात nsp9 बनवते आणि इतर nestoviridae मध्ये, NiRAN-RdRp विषाणूजन्य पॉलीप्रोटीनपासून स्वतंत्र nsp म्हणून सोडले जाणे अपेक्षित आहे.कोरोनाव्हायरसमध्ये, NiRAN डोमेनमध्ये 1/450 अवशेष असतात आणि ते लिंकर क्षेत्राद्वारे (16?19) C-टर्मिनल RdRp डोमेनशी जोडलेले असतात.Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) मध्ये, recombinant nsp9 Mn2+ आयन-आश्रित (स्वत:) UMPylation आणि GMPylation क्रियाकलाप दर्शविते, जे नेस्टोव्हायरस, AN, BN आणि CN मधील तीन संरक्षित अनुक्रम आधारांवर अवलंबून असतात.जेथे N म्हणजे NiRAN) (16).या आकृतिबंधांचे एन-टर्मिनल फ्लॅंकिंग कमी पुराणमतवादी आकृतिबंध preAN आहे.यातील काही अवशेष दूरस्थपणे संबंधित प्रोटीन किनेसमध्ये देखील संरक्षित केले जातात, जेथे ते न्यूक्लियोसाइड ट्रायफॉस्फेट (NTP) बंधनकारक आणि उत्प्रेरक क्रियाकलाप (20, 21) मध्ये गुंतलेले असल्याचे दर्शविले गेले आहे.या निरीक्षणाशी सुसंगत, स्यूडोमोनास सिरिंजमधील स्यूडोकिनेज सेलो मधील अनेक प्रमुख सक्रिय साइट अवशेष नुकत्याच प्रकाशित झालेल्या SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 सुपरकॉम्प्लेक्ससह एकत्र केले जाऊ शकतात.जतन केलेले कोरोनाव्हायरस NiRAN अवशेष इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्ट्रक्चरमध्ये सुपरइम्पोज केलेले आहेत.रीकॉम्बीनंट प्रोटीन (17).असा अंदाज आहे की दस्तऐवजीकरण (स्वत:) U/GMPylation NMP (सध्या अज्ञात) सब्सट्रेट (16) मध्ये हस्तांतरित करण्यासाठी एक क्षणिक स्थिती निर्माण करेल, आणि NiRAN आणि प्रोटीन किनेज (17, 19) मधील संरचनात्मक समानता ही गृहितक आहे. NiRAN इतर प्रथिने सुधारित करते.
नेस्टेड व्हायरस आणि RdRp पासून अनुवांशिक विभक्ततेसह त्याचे अद्वितीय आणि अद्वितीय पद्धतशीर संबंध यासह अनेक वैशिष्ट्ये, नेस्टेड व्हायरससाठी NiRAN ला एक वाजवी प्रमुख नियामक एन्झाइम बनवते, जे त्यांच्या उदय आणि ओळखीसाठी महत्त्वपूर्ण आहे.पूर्वी, जीनोम/सबजेनोमिक भाषांतर किंवा प्रतिकृती/लिप्यंतरण नियंत्रित करण्यासाठी NiRAN चा समावेश असलेली तीन संभाव्य कार्ये म्हणतात.त्यावेळी उपलब्ध असलेल्या दुर्मिळ आणि अपूर्ण डेटाचा विचार करताना, प्रत्येक फंक्शनचे त्याचे फायदे आणि तोटे आहेत (16).या संशोधनामध्ये, आम्ही कोरोनाव्हायरसचे बायोकेमिकल आणि रिव्हर्स अनुवांशिक अभ्यास एकत्र करणे हे दोन पिढ्यांचे प्रतिनिधित्व करण्याचे उद्दिष्ट ठेवतो आणि आमचे निष्कर्ष कोरोनाव्हायरस कुटुंबातील नैसर्गिक उत्परिवर्तनाच्या उत्क्रांती पार्श्वभूमीत ठेवायचे, जेणेकरून या रहस्यमय क्षेत्राबद्दल अंतर्दृष्टी मिळू शकेल.आम्ही RTC मधील नैसर्गिक लक्ष्यांच्या ओळखीद्वारे NiRAN च्या समजून घेण्यात मोठ्या प्रगतीचा अहवाल देतो, जे (तीन उपलब्ध गृहितकांपैकी) नेस्टेड व्हायरस RNA चे संश्लेषण सुरू करण्यात या डोमेनच्या भूमिकेत योगदान देते.हे संशोधन व्हायरस होस्ट इंटरफेसवर NiRAN च्या इतर भूमिकांसाठी शक्यता देखील उघडते.
कोरोना विषाणू nsp12-संबंधित NiRAN डोमेनच्या एन्झाईमॅटिक गुणधर्मांना वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी, आम्ही E. coli मध्ये मानवी कोरोनाव्हायरस 229E (HCoV-229E) nsp12 चे रीकॉम्बिनंट फॉर्म तयार केले, C-टर्मिनस येथे His6 टॅगसह, आणि एकत्र केले. [α32-P] सह प्रथिने MnCl2 च्या उपस्थितीत NTP सह एकत्रितपणे उष्मायन करतात जसे की सामग्री आणि पद्धतींमध्ये वर्णन केले आहे.प्रतिक्रिया उत्पादनाच्या विश्लेषणाने nsp12 (106 kDa) सह स्थलांतरित होणार्‍या रेडिओलेबल प्रोटीनची उपस्थिती दर्शविली, जे सूचित करते की कोरोनाव्हायरस nsp12 सहसंयोजक प्रथिने-NMP ऍडक्ट्सची निर्मिती उत्प्रेरित करते, प्राधान्याने युरिडिन मोनोफॉस्फेट (यूएमपी) (आकृती 1) ब).परिमाणवाचक विश्लेषणाने दर्शविले की इतर न्यूक्लियोटाइड्सच्या तुलनेत, यूएमपी इनकॉर्पोरेशनची सिग्नल तीव्रता 2 ते 3 पट वाढली (आकृती 1C).हा डेटा कोरोनाव्हायरस (16) च्या NiRAN डोमेनच्या अंदाजित NMP ट्रान्सफरेज क्रियाकलापाशी सुसंगत आहे, परंतु कोरोनाव्हायरस आणि धमनी व्हायरसच्या NiRAN डोमेनची न्यूक्लियोटाइड प्राधान्ये भिन्न आहेत हे सूचित करते.
HCoV-229E nsp12 ची स्वयं-NMPylation क्रियाकलाप.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) 30 मिनिटांसाठी 6 mM MnCl2 च्या उपस्थितीत नियुक्त [α-32P] NTP सह उष्मायन करण्यात आले (तपशीलांसाठी सामग्री आणि पद्धती पहा).प्रतिक्रिया उत्पादने SDS-PAGE द्वारे विभक्त केली गेली आणि Coomassie चमकदार निळ्या रंगाने डाग केली गेली.(ब) रेडिओलेबल प्रथिने फॉस्फरस इमेजिंगद्वारे दृश्यमान आहेत.nsp12-His6 आणि प्रोटीन आण्विक वस्तुमान मार्कर (किलोडाल्टनमध्ये) ची स्थिती A आणि B मध्ये दर्शविली आहे. (C) किरणोत्सर्गी सिग्नलची तीव्रता (म्हणजे ± SEM) तीन स्वतंत्र प्रयोगांमधून निर्धारित केली गेली.*P≤0.05.सिग्नल सामर्थ्य (टक्केवारी) UTP शी संबंधित आहे.
जरी NiRAN-संबंधित एन्झाइम क्रियाकलाप सेल कल्चर (16) मध्ये EAV आणि SARS-CoV च्या प्रतिकृतीसाठी आवश्यक असल्याचे दर्शविले गेले असले तरी, विशिष्ट NiRAN कार्य आणि संभाव्य लक्ष्य अद्याप निर्धारित केले गेले नाहीत.NiRAN आणि प्रथिने किनेज सारखी फोल्ड (17, 22) असलेल्या प्रथिनांच्या कुटुंबातील अलीकडेच नोंदवलेली संरचनात्मक समानता आम्हाला NiRAN इतर प्रथिनांचे NMPylation उत्प्रेरित करते या गृहीतकाची चाचणी घेण्यास प्रवृत्त करते.आम्ही HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) द्वारे एन्कोड केलेल्या नॉन-स्ट्रक्चरल प्रोटीन्ससह संभाव्य समरूप लक्ष्यांचा एक संच तयार केला आहे, प्रत्येकामध्ये C-टर्मिनल His6 टॅग (SI परिशिष्ट, टेबल S1) आहे, आणि ही प्रथिने nsp12 च्या उपस्थितीत किंवा अनुपस्थितीत [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) सह उष्मायन करा.बोवाइन सीरम अल्ब्युमिन आणि E. coli मध्ये उत्पादित MBP-LacZα फ्यूजन प्रोटीन नियंत्रणे म्हणून काम करतात (आकृती 2A, लेन्स 1 ते 7).सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलियाक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस (SDS-PAGE) आणि ऑटोरेडिओग्राफीद्वारे रेडिओलेबल प्रथिनेचे विश्लेषण केले गेले आणि असे आढळून आले की nsp12 आणि nsp9 असलेल्या प्रतिक्रियामध्ये एक मजबूत किरणोत्सर्गी सिग्नल होता.सिग्नलची स्थिती nsp9 च्या आण्विक वस्तुमानाशी संबंधित आहे, nsp9 चे nsp12-मध्यस्थ UMPylation दर्शवते (आकृती 2B, ट्रॅक 7).इतर कोणतीही चाचणी प्रथिने UMPylated आढळली नाहीत, ज्यामुळे आम्हाला असा निष्कर्ष काढता आला की nsp9 हा nsp12 चा एक विशिष्ट सब्सट्रेट आहे.आकृती 1 मध्ये दर्शविलेल्या स्वयं-NMPylation डेटाशी सुसंगत, nsp12 सर्व चार NMPs nsp9 मध्ये हस्तांतरित करण्यास सक्षम आहे, जरी कार्यक्षमता भिन्न आहे, UMP> एडेनोसाइन मोनोफॉस्फेट (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) चित्र).3 A आणि B).या परीक्षणामध्ये वापरलेल्या परिस्थितीनुसार (प्रतिक्रिया आणि एक्सपोजर वेळ कमी करा, nsp12 ची एकाग्रता कमी करा; साहित्य आणि पद्धती), nsp12 चे स्वयं-NMPylation शोधले जाऊ शकले नाही (आकृती 2B, लेन 7 आणि आकृती 1B ची तुलना करा), जे प्रभावी (आणि अनेक फेऱ्या) UMP nsp12 वरून nsp9 वर सरकले.आकृती 3C मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे UMP ट्रान्सफरेज क्रियाकलापासाठी Mn2+ आयनची उपस्थिती आवश्यक आहे, तर Mg2+ च्या उपस्थितीत फक्त किमान UMP ट्रान्सफरेज क्रियाकलाप दिसून आला आणि चाचणी केलेल्या इतर दोन डायव्हॅलेंट कॅशन्सच्या उपस्थितीत कोणतीही क्रियाकलाप नाही.साइटिडाइन ट्रायफॉस्फेट (सीटीपी), ग्वानोसिन ट्रायफॉस्फेट (जीटीपी), आणि एडेनोसिन ट्रायफॉस्फेट (एटीपी) (एसआय परिशिष्ट, आकृती S1) असलेल्या एनएमपीलायशन अॅसेसमध्ये समान डेटा प्राप्त झाला.
nsp9 चे HCoV-229E nsp12-मध्यस्थ UMPylation.प्रोटीन सब्सट्रेट्सची मालिका (बोवाइन सीरम अल्ब्युमिन, MBP-lacZα, आणि ORF1a द्वारे एन्कोड केलेल्या C-टर्मिनल His6 सह लेबल केलेली HCoV-229E nsps ची मालिका) HCoV-229E nsp12-Histed⁺ च्या UMPylation क्रियाकलापाचे मूल्यांकन करण्यासाठी वापरली गेली. प्रथिनेसामग्री आणि पद्धतींमध्ये वर्णन केल्यानुसार nsp12 च्या अनुपस्थितीत (A) किंवा उपस्थिती (B) मध्ये 10 मिनिटे [α-32P] UTP सह प्रथिने उबवा.A आणि B च्या शीर्षस्थानी, SDS-polyacrylamide जेल कूमासी ब्रिलियंट ब्लूने स्टेन्ड केलेले आहे आणि A आणि B च्या तळाशी, संबंधित ऑटोरेडिओग्राम दाखवले आहेत.प्रथिने आण्विक वस्तुमान मार्करची स्थिती (किलोडाल्टन्समध्ये) डावीकडे दिली आहे.nsp12-His6 (B, top) ची स्थिती आणि nsp9-His6 (B, लेन 7) सह nsp12-His6 च्या उष्मायनादरम्यान पाहिलेले किरणोत्सर्गी सिग्नल देखील सूचित केले आहेत, जे सूचित करतात की [α-32P] UMP ते nsp9-His6 ( 12.9 kDa), जे इतर प्रथिनांसाठी तपासले गेले नाही.
HCoV-229E NiRAN-मध्यस्थ बायोकेमिकल आणि nsp9 NMPylation चे विषाणूजन्य वैशिष्ट्य.(A आणि B) प्रतिक्रियेमध्ये वापरल्या जाणार्‍या न्यूक्लियोटाइड सह-सबस्ट्रेटची भूमिका.Nsp12-His6 आणि nsp9-His6 हे मानक NMPylation परखमध्ये वेगवेगळ्या [α-32P] NTP च्या उपस्थितीत मिश्रित आणि उष्मायन केले जातात.(A, शीर्ष) Coomassie-stained nsp9-His6 SDS-PAGE द्वारे विभक्त.(ए, तळ) जेलच्या समान क्षेत्राचा ऑटोरेडिओग्राफ.(ब) नियुक्त केलेल्या न्यूक्लियोटाइड कोफॅक्टरच्या उपस्थितीत सापेक्ष क्रियाकलाप (म्हणजे ± SEM) तीन स्वतंत्र प्रयोगांमधून निर्धारित केले जाते.*P≤0.05.(C) धातूच्या आयनांची भूमिका.[α-32P] UTP आणि भिन्न धातू आयनांच्या उपस्थितीत प्रमाणित NMPylation चाचणी दर्शविली आहे, प्रत्येकाची एकाग्रता 1 mM आहे.C मध्ये, शीर्षस्थानी, Coomassie stained nsp9-His6 दर्शविले आहे आणि C मध्ये, तळाशी, संबंधित ऑटोरेडिओग्राफी दर्शविली आहे.लेबल केलेल्या प्रथिनांचा आकार (किलोडाल्टन्समध्ये) A आणि C च्या डावीकडे दर्शविला आहे. (D) HCoV-229E nsp12-His6 चे उत्परिवर्ती स्वरूप निर्दिष्ट अमिनो आम्ल प्रतिस्थापन [α-32P]UTP मध्ये आहे, वर्णन केल्याप्रमाणे साहित्य आणि पद्धतींमध्ये.NMPylation प्रतिक्रिया मध्ये उत्पादित radiolabeled nsp9-His6 फॉस्फोरिलेशन इमेजिंग (D, top) द्वारे शोधले जाते.वाइल्ड-टाइप (wt) प्रोटीनशी तुलना केलेली सापेक्ष क्रिया D मध्ये दर्शविली आहे आणि तळ तीन स्वतंत्र प्रयोगांमधून सरासरी (±SEM) म्हणून घेतला आहे.तारका अ-संरक्षित अवशेषांचे प्रतिस्थापन दर्शवतात.(ई) पी 1 पेशींच्या कल्चर सुपरनॅटंटमधील विषाणू टायटर संक्रमणानंतर 24 तासांनी प्लेक तपासणीद्वारे निर्धारित केले गेले.इंजिनियर केलेल्या HCoV-229E म्युटंटच्या NiRAN डोमेनमधील कोडॉन प्रतिस्थापन सूचित केले आहेत (अवशेष क्रमांकन pp1ab मधील त्यांच्या स्थानावर आधारित आहे).प्रतिकृती-कमतर RdRp सक्रिय साइट म्युटंट nsp12_DD4823/4AA नियंत्रण म्हणून वापरले गेले.
NiRAN च्या सक्रिय साइटची सखोल माहिती मिळविण्यासाठी आणि nsp9-विशिष्ट NMP ट्रान्सफरेजच्या क्रियाकलापाशी संबंधित अवशेष निश्चित करण्यासाठी, आम्ही उत्परिवर्तन विश्लेषण केले, ज्यामध्ये आम्ही NiRAN AN, BN आणि CN motifs मधील पुराणमतवादी अवशेष बदलले ( 16) तो आला (SI परिशिष्ट, आकृती S2) आहे.याव्यतिरिक्त, पुराणमतवादी Arg-to-Lys किंवा Lys-to-Arg प्रतिस्थापनांच्या प्रभावाचे दोन प्रकरणांमध्ये मूल्यांकन केले गेले.(नकारात्मक) नियंत्रण म्हणून, कोरोनाव्हायरस आणि इतर नेस्टेड व्हायरसच्या NiRAN डोमेनमध्ये किंवा कमी संरक्षित नसलेले अवशेष Ala ने बदलले जातात. K4116A (मोटिफ preAN मध्ये), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (मोटिफ) बदलून BN) आणि D4280A (CN) nsp12 द्वारे nsp9 NMPylation लक्षणीयरीत्या कमी करतात किंवा काढून टाकतात, तर पुराणमतवादी प्रतिस्थापनांसह प्रथिने (R4178K), K4116R) त्यांच्या क्रियाकलापातील 60% आणि 80% टिकवून ठेवतात, जे त्यांच्या संबंधित बाजूंच्या निर्बंधांमध्ये शिथिलता दर्शवते. चेन भौतिक-रासायनिकदृष्ट्या संवेदनशील असतात (आकृती 3D).इतर अनेक संरक्षित अवशेष E4145A, D4273A, F4281A आणि D4283A बदलणे खूपच कमी हानिकारक आहे आणि nsp9 UMPylation फक्त माफक प्रमाणात कमी होते.इतर NTPs (आकृती 3D आणि SI परिशिष्ट, आकृती S3) चा समावेश असलेल्या nsp9 NMPylation प्रतिक्रियांमध्ये तत्सम परिणाम प्राप्त झाले, विशिष्ट अमीनो ऍसिड प्रतिस्थापनांवरील निरीक्षण प्रभाव वापरलेल्या न्यूक्लियोटाइड को-सबस्ट्रेटच्या प्रकारापासून स्वतंत्र आहेत याची पुष्टी करते.पुढे, आम्ही सेल कल्चरमध्ये कोरोनाव्हायरसच्या प्रतिकृतीवर या nsp12 प्रतिस्थापनांच्या संभाव्य प्रभावाची चाचणी केली.यासाठी, आम्ही 5 -7 पेशींचे लिप्यंतरण करण्यासाठी रीकॉम्बीनंट व्हॅक्सिनिया व्हायरस (23, 24) मध्ये क्लोन केलेले योग्य अनुवांशिक अभियंता पूरक DNA (cDNA) टेम्पलेट वापरले.या पेशींमध्ये निर्माण झालेल्या संसर्गजन्य विषाणूंच्या संततीचे टायट्रेशन दाखवून दिले की बहुतेक HCoV-229E NiRAN उत्परिवर्तन व्यवहार्य नव्हते (आकृती 3E).व्यवहार्य नसलेल्या व्हायरल म्युटंट्सच्या गटामध्ये विट्रो (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A) मधील NMP ट्रान्सफरेज क्रियाकलाप काढून टाकण्यासाठी किंवा लक्षणीयरीत्या कमी करण्यासाठी दर्शविले गेलेले पर्याय समाविष्ट आहेत, परंतु इतर दोन पर्याय आहेत (K4116R, E480A) % राखीव?त्यांची इन विट्रो NMPylation क्रियाकलाप सूचित करते की अतिरिक्त निर्बंध गुंतलेले आहेत.त्याचप्रमाणे, इतर दोन उत्परिवर्तन (R4178K, F4281A) ज्यामुळे NiRAN च्या इन विट्रो NMPylation क्रियाकलापात मध्यम घट झाली, त्यामुळे थेट विषाणू निर्माण झाले, तथापि, या विषाणूंनी प्रतिकृतीद्वारे टायटर्स लक्षणीयरीत्या कमी केले.आकृती 3D मध्ये दर्शविलेल्या इन विट्रो क्रियाकलाप डेटाशी सुसंगत, कोरोनाव्हायरस आणि/किंवा इतर नेस्टेड व्हायरस (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) मध्ये संरक्षित नसलेल्या इतर चार अवशेषांच्या जागी व्यवहार्य व्हायरसची निर्मिती केली, संतती असूनही जंगली-प्रकारच्या विषाणूच्या तुलनेत माफक प्रमाणात कमी झालेले टायटर (आकृती 3E).
NiRAN-मध्यस्थ NMP हस्तांतरण क्रिया सक्रिय RdRp डोमेनवर अवलंबून आहे की नाही याचा अभ्यास करण्यासाठी, RdRp motif C मधील divalent metal ion (11) च्या समन्वयामध्ये गुंतलेले दोन संरक्षित Asp अवशेष Ala ने बदलले. परिणामी प्रोटीन nsp12_DD4823/4AA राखून ठेवते. त्याची nsp9 NMPylation क्रियाकलाप, हे दर्शविते की nsp12-मध्यस्थ इन विट्रो nsp9 NMPylation क्रियाकलापांना पॉलिमरेज क्रियाकलाप आवश्यक नाही (SI परिशिष्ट, आकृती S4).
nsp12 साठी nsp9-विशिष्ट NMP ट्रान्सफरेज क्रियाकलाप स्थापित केल्यानंतर, आम्ही मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) द्वारे NMP-nsp9 अॅडक्ट वैशिष्ट्यीकृत करण्याचा प्रयत्न केला.रीकॉम्बीनंट HCoV-229E nsp9 च्या संपूर्ण प्रोटीन मास स्पेक्ट्रमने 12,045 Da (आकृती 4A) वर शिखर दर्शविले.nsp12 च्या जोडण्याने nsp9 ची गुणवत्ता बदलली नाही, हे दर्शविते की nsp12 आणि nsp9 वापरलेल्या परिस्थितीत (विकृतीकरण) (आकृती 4A) स्थिर कॉम्प्लेक्स तयार करणार नाहीत.UTP आणि GTP च्या उपस्थितीत, अनुक्रमे nsp9 आणि nsp12 असलेल्या प्रतिक्रियेच्या वस्तुमान मोजमापावरून असे दिसून आले की UTP चे प्रथिन वस्तुमान 306 Da हलविले गेले आणि GTP चे प्रथिन वस्तुमान 345 Da हलविले, हे दर्शविते की प्रत्येक nsp9 रेणू UMP किंवा GMP ला बांधतो. (चित्र 4) C आणि D).असा अंदाज आहे की NiRAN-मध्यस्थ nsp9 NMPylation साठी आवश्यक ऊर्जा NTP हायड्रोलिसिस आणि पायरोफॉस्फेट रीलिझमधून येते.या प्रतिक्रियेमध्ये nsp12 (एन्झाइम) पेक्षा nsp9 (लक्ष्य) 10 पट जास्त वापरण्यात आला असला तरी, nsp9 चे जवळजवळ संपूर्ण NMPylation दिसून आले, जे nsp12 आणि nsp9 मधील परस्परसंवाद अल्पकालीन असल्याचे दर्शविते, आणि nsp12 अधिक nsp9 NMPylate करू शकते. इन विट्रो रेणू.
nsp12 आणि UTP किंवा GTP च्या उपस्थितीत nsp9 चे एकल NMPylation.HCoV-229E nsp9 (SI परिशिष्ट, सारणी S1) (AD) चे विघटित पूर्ण प्रोटीन मास स्पेक्ट्रम दाखवले आहे.(A) nsp9 एकटा, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP च्या उपस्थितीत, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP च्या उपस्थितीत.
nsp12 द्वारे UMPylated nsp9 अवशेष निश्चित करण्यासाठी, nsp9-UMP ट्रिप्सिनने क्लीव्ह केले होते.परिणामी पेप्टाइड्स नॅनो-हाय परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (HPLC) द्वारे वेगळे केले गेले आणि टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS/MS) ऑनलाइन विश्लेषण केले गेले.बायोनिक सॉफ्टवेअर पॅकेज (प्रोटीन मेट्रिक्स) वापरून डेटा विश्लेषणाने एन-टर्मिनल अमीनो ऍसिडचे UMPylation दर्शविले.याची पुष्टी व्यक्तिचलितपणे केली जाते.पूर्ववर्ती पेप्टाइड [UMP]NNEIMPGK (SI परिशिष्ट, आकृती S5A) च्या टेंडम मास स्पेक्ट्रमने 421 m/z वर एक तुकडा उघड केला, जे दर्शविते की UMP nsp9 च्या अवशेष 1 ला बांधते.
nsp9 च्या N-टर्मिनसवर, Asn ऑर्थोकोरोनाविरिने (SI परिशिष्ट, आकृती S6) च्या सदस्यांमध्ये संरक्षित आहे.जरी आमचा असा विश्वास आहे की N-टर्मिनल प्राथमिक अमाइन नायट्रोजन हे UMP साठी बहुधा स्वीकारणारा आहे, आम्ही N-टर्मिनलवर NMP बंधनकारक असल्याचा अतिरिक्त पुरावा मिळवण्याचा निर्णय घेतला.या कारणास्तव, एचपीएलसीद्वारे शुद्ध केलेले नॉन-एनएमपीलेटेड आणि एनएमपीलेटेड एन-टर्मिनल पेप्टाइड एनएसपी9 एसीटोन आणि सोडियम सायनोबोरोहायड्राइडच्या उपस्थितीत प्राप्त केले गेले.या परिस्थितीत, प्रोपाइल (25) सह केवळ विनामूल्य प्राथमिक अमाईन सुधारित केले जाऊ शकतात.एन-टर्मिनल एनएसपी9-व्युत्पन्न पेप्टाइडमध्ये एनएनईआयएमपीजीके या क्रमाने दोन प्राथमिक अमाईन असतात, एक Asn च्या N-टर्मिनसवर आणि दुसरा C-टर्मिनस येथे Lys च्या बाजूच्या साखळीवर.म्हणून, प्रोपाइल गट दोन्ही टोकांना सादर केले जाऊ शकतात.नॉन-एनएमपीलेटेड पेप्टाइड्सचे काढलेले आयन क्रोमॅटोग्राम एसआय परिशिष्ट, आकृती S5B मध्ये दर्शविले आहेत.अपेक्षेप्रमाणे, एन-टर्मिनल आणि सी-टर्मिनल (मोनो)प्रॉपिलेटेड (SI परिशिष्ट, आकृती S5B, वरची लेन) आणि डिप्रोपायलेटेड पेप्टाइड्स (SI परिशिष्ट, आकृती S5B, लोअर लेन) ओळखले जाऊ शकतात.nsp9 च्या NMPylated N-टर्मिनल पेप्टाइडच्या वापराने हा नमुना बदलतो.या प्रकरणात, केवळ सी-टर्मिनल प्रोपिलेटेड पेप्टाइड्स ओळखले जाऊ शकतात, परंतु एन-टर्मिनल प्रोपिलेटेड पेप्टाइड्स आणि डिप्रोपायलेटेड पेप्टाइड्स ओळखले जात नाहीत (SI परिशिष्ट, आकृती S5C), हे दर्शविते की यूएमपी हे टाळण्यासाठी एन-टर्मिनल प्राथमिक अमाइनमध्ये स्थानांतरित केले गेले आहे. बदल करण्यापासून गट.
पुढे, लक्ष्य-विशिष्ट मर्यादा परिभाषित करण्यासाठी आम्ही nsp9 च्या N-टर्मिनसवर संरक्षित अवशेष (Ala किंवा Ser सह) बदलतो किंवा हटवतो.आमच्या एमएस डेटाच्या आधारावर हे दर्शविते की NiRAN nsp9 च्या N-टर्मिनल अवशेषांच्या प्राथमिक अमाइनसह nsp9-NMP अॅडक्ट बनवतो, आम्ही असे गृहित धरले की nsp9 NMPylation ला nsp9 N-टर्मिनल सोडण्यासाठी व्हायरल मास्टर प्रोटीज (Mpro, nsp5) आवश्यक आहे. त्याचे पॉलीप्रोटीन अग्रदूत.या गृहीतकाची चाचणी घेण्यासाठी, आम्ही E. coli मध्ये nsp9 असलेले पूर्ववर्ती प्रोटीन nsp7-11 तयार केले आणि [α-32P] UTP (सामग्री आणि पद्धती) च्या उपस्थितीत मानक NMPylation चाचणी केली.आकृती 5A (लेन 3) मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, न कापलेले nsp7-11 पूर्ववर्ती nsp12 सह रेडिओलेबल केलेले नाही.याउलट, nsp7-11 पूर्ववर्ती पासून nsp9 (आणि इतर nsps) सोडण्यासाठी रीकॉम्बिनंट nsp5 द्वारे क्लीव्ह केले असल्यास, nsp9 सह स्थलांतरित होणारे एक रेडिओलेबल प्रथिन आढळले आहे, आमच्या निष्कर्षाची पुष्टी करते की NiRAN आणि N- सहसंयोजक nsp9-NMP जाहिरातींची निवडक निर्मिती. .N-टर्मिनल Asn चे टर्मिनल प्राथमिक अमाइन (pp1a/pp1ab मधील स्थिती 3825).या निष्कर्षाला nsp9 रचना वापरून केलेल्या प्रयोगांद्वारे देखील समर्थन दिले जाते, ज्यामध्ये N-टर्मिनसमध्ये एक किंवा दोन अतिरिक्त अवशेष असतात.दोन्ही प्रकरणांमध्ये, nsp9 चे NiRAN-मध्यस्थ UMPylation रद्द करण्यात आले (SI परिशिष्ट, आकृती S7).पुढे, आम्ही nsp9 च्या N-टर्मिनलवर 3825-NNEIMPK-3832 पेप्टाइड अनुक्रमातून हटवलेल्या एक किंवा दोन Asn अवशेषांसह एक प्रोटीन तयार केले.दोन्ही प्रकरणांमध्ये, nsp9 UMPylation पूर्णपणे अवरोधित केले गेले (आकृती 5B), वास्तविक nsp9 N-टर्मिनस NMP रिसेप्टर म्हणून कार्य करते याचा अतिरिक्त पुरावा प्रदान करते.
nsp9 ची प्रोटीओलाइटिक प्रक्रिया आणि nsp12-मध्यस्थ UMPylation मध्ये N-टर्मिनल अवशेषांची भूमिका.(A) nsp9 UMPylation साठी विनामूल्य nsp9 N-टर्मिनल आवश्यक आहे.Nsp7-11-His6 हे रीकॉम्बीनंट Mpro (nsp5-His6) च्या उपस्थितीत किंवा अनुपस्थितीत UTP असलेल्या NMPylation डिटेक्शन बफरमध्ये 30 °C वर पूर्व-उष्मायन केले जाते.3 तासांनंतर, सामग्री आणि पद्धतींमध्ये वर्णन केल्यानुसार nsp12-His6 जोडून NMPylation परख सुरू करा.nsp5-His6 (लेन 1) आणि nsp9-His6 (लेन 2) असलेली प्रतिक्रिया नियंत्रण म्हणून वापरली गेली.10 मिनिटांनंतर, प्रतिक्रिया संपुष्टात आली आणि प्रतिक्रिया मिश्रण SDS-PAGE द्वारे वेगळे केले गेले.प्रथिने कूमासी ब्रिलियंट ब्लू (ए, टॉप) सह डागलेले होते.Nsp7-11-His6 पूर्ववर्ती आणि nsp5-His6 मध्यस्थ क्लीवेजच्या परिणामी प्रक्रिया केलेले उत्पादन उजवीकडे दर्शविले आहे.कृपया लक्षात घ्या (त्यांच्या लहान आकारामुळे) की या जेलमध्ये nsp7 आणि nsp11-His6 शोधण्यायोग्य नाहीत आणि प्रतिक्रिया nsp5-His6 सह पूरक आहे (लेन्स 1 आणि 4; nsp5-His6 ची स्थिती घन वर्तुळाद्वारे दर्शविली जाते) किंवा nsp9-His6 (लेन 2) मध्ये अवशिष्ट अशुद्धता म्हणून थोड्या प्रमाणात MBP (ओपन सर्कलद्वारे दर्शविलेले) असते कारण ते MBP फ्यूजन प्रोटीन (SI परिशिष्ट, टेबल S1) म्हणून व्यक्त केले जातात.(B) Nsp9-His6 वेरिएंटमध्ये एक किंवा दोन N-टर्मिनल Asn अवशेष नाहीत (pp1a/pp1ab मधील स्थितीनुसार अवशेष क्रमांकन) आणि nsp12-His6 आणि [α-32P] UTP सह शुद्ध आणि उष्मायन केले जाते.B, Coomassie सह स्टेन्ड केलेले SDS-PAGE शीर्षस्थानी दर्शविले आहे, B, संबंधित ऑटोरेडिओग्राफ तळाशी दर्शविला आहे.आण्विक वजन मार्करची स्थिती (किलोडाल्टन्समध्ये) डावीकडे दर्शविली आहे.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-टर्मिनल संरक्षित अवशेष Ala किंवा Ser ने बदलले गेले आणि nsp12-His6 मध्यस्थी UMPylation प्रतिक्रियामध्ये समान प्रमाणात प्रथिने वापरली गेली.प्रतिक्रिया उत्पादने SDS-PAGE द्वारे विभक्त केली गेली आणि कूमासी ब्रिलियंट ब्लू (C, top) सह डाग केली गेली आणि रेडिओलेबल केलेले nsp9-His6 फॉस्फोरेसेन्स इमेजिंग (C, मध्य) द्वारे आढळले.संदर्भ म्हणून जंगली-प्रकार (wt) प्रथिने वापरून (100% वर सेट), संबंधित NMPylation क्रियाकलाप (म्हणजे ± SEM) तीन स्वतंत्र प्रयोगांमधून मोजले गेले.(D) HCoV-229E वाइल्ड-प्रकार Huh-7 पेशींनी संक्रमित Huh-7 पेशींच्या p1 सेल कल्चर सुपरनॅटंटमधील व्हायरस टायटर्स आणि nsp9 मध्ये नियुक्त अमीनो ऍसिड बदलणारे उत्परिवर्ती प्लेक परखणीद्वारे निर्धारित केले गेले.प्रतिकृती-कमतर RdRp मोटिफ C दुहेरी उत्परिवर्ती DD4823/4AA नकारात्मक नियंत्रण म्हणून वापरले गेले.
nsp9 चे N-टर्मिनस (विशेषत: स्थान 1, 2, 3, आणि 6) ऑर्थोकोरोनाविरिने उपपरिवाराच्या सदस्यांमध्ये (SI परिशिष्ट, आकृती S6) अतिशय संरक्षित आहे.nsp12-मध्यस्थ nsp9 NMPylation मध्ये या अवशेषांच्या संभाव्य भूमिकेचा अभ्यास करण्यासाठी, nsp9 च्या N-टर्मिनसवर सलग दोन Asn अवशेष Ala किंवा Ser (एकटे किंवा संयोजनात) ने बदलले गेले.जंगली-प्रकार nsp9 च्या तुलनेत, N3825 ला Ala किंवा Ser ने बदलल्याने nsp12-मध्यस्थ UMPylation (आकृती 5C) मध्ये दुप्पट घट झाली.NMPylation N-टर्मिनल अवशेषांच्या बाजूच्या साखळीऐवजी N-टर्मिनल प्राथमिक अमाइनवर होते या आमच्या निष्कर्षाशी सुसंगत, आम्ही N3825A आणि N3825S च्या बदलीसह लक्षणीय अवशिष्ट NMPylation पाळले.विशेष म्हणजे, जर दुसरा Asn Ala किंवा Ser ने बदलला असेल, तर nsp9 UMPylation अधिक जोरदारपणे कमी होते (10 पेक्षा जास्त वेळा), तर Ala ची जागा 3, 4, आणि 6 वर बदलल्याने nsp9 UMPylation वर फक्त मध्यम परिणाम होतो (आकृती 2). ) .5C).एटीपी, सीटीपी किंवा जीटीपी (एसआय परिशिष्ट, आकृती S8) वापरून तत्सम परिणाम प्राप्त झाले.एकत्रितपणे, हे डेटा nsp9 NMPylation मध्ये N2826 (nsp9 मध्ये स्थिती 2) ची मुख्य भूमिका दर्शवतात.
nsp9 आणि NMPylation च्या N-टर्मिनसमधील कार्यात्मक सहसंबंधाचा अतिरिक्त पुरावा मिळविण्यासाठी, आम्ही कोरोनाव्हायरस कुटुंबाच्या nsp9 अनुक्रमाचे एकाधिक अनुक्रम संरेखन (MSA) केले (104 आणि 113 अवशेषांमधील बदल) (SI परिशिष्ट, आकृती S6).एकूण, विविध सस्तन प्राणी, पक्षी आणि सरपटणाऱ्या यजमानांना संक्रमित करणाऱ्या ऑर्थोकोरोनाविरिने उपकुटुंबातील 5 प्रजातींच्या 47 (ज्ञात आणि प्रचलित) प्रजातींमध्ये, एकूण केवळ 8 अवशेष अपरिवर्तनीय असल्याचे आढळले.nsp9 च्या दुय्यम संरचना घटकांमधील चक्रांमध्ये, हटवणे आणि समाविष्ट करणे यासह सर्वात व्यापक बदल, मागील संरचनात्मक अभ्यासांद्वारे (26 ??28) निर्धारित केल्यानुसार आढळून आले.nsp9 च्या C-टर्मिनल भागाच्या β स्ट्रँड आणि α हेलिक्समध्ये पाच अपरिवर्तनीय अवशेष आढळले.तीन अपरिवर्तनीय अवशेष nsp9 च्या N टर्मिनसचे NNE आकृतिबंध बनवतात.हे उघड झाले आहे की या आकृतिबंधाचा दुसरा Asn हा एकमेव अपरिवर्तनीय अवशेष आहे, जो दूरस्थपणे संबंधित बेडूक कोरोनाव्हायरसच्या काल्पनिक nsp9 द्वारे देखील सामायिक केला जातो आणि अल्फालेटोव्हायरसच्या लेटोविरिना या उपकुटुंबातील मायक्रोहायला लेटोव्हायरस 1 प्रजातीचे प्रतिनिधित्व करतो.nsp9 दुय्यम संरचना घटकांमधील अवशेषांचे संवर्धन फोल्डिंग किंवा ज्ञात आरएनए बंधनकारक गुणधर्म राखण्यासाठी संरचनात्मक विचारांद्वारे तर्कसंगत केले जाऊ शकते.तथापि, हे तर्क NNE च्या संवर्धनावर लागू होत नाही असे दिसत नाही आणि या अभ्यासापूर्वी, ट्रिपेप्टाइड अनुक्रमातील भिन्नता मर्यादित करणार्‍या प्रतिबंधांचे स्वरूप पूर्णपणे अस्पष्ट होते.
कोरोनाव्हायरस प्रतिकृतीमध्ये nsp9-NMPylation आणि NNE संवर्धनाचे महत्त्व निश्चित करण्यासाठी, आम्ही HCoV-229E उत्परिवर्तन तयार केले, जे nsp9 N-टर्मिनल अवशेषांचे एकल किंवा दुहेरी पर्याय धारण करतात, हे दर्शविते की nsp9 NMPylation विट्रोमध्ये हानिकारक आहे.आम्ही सुरू करण्यापूर्वी, आम्ही या प्रश्नाचे उत्तर देण्याचा प्रयत्न करतो की हे पर्याय (nsp8|9 क्लीव्हेज साइटजवळ) C-टर्मिनल pp1a क्षेत्राच्या प्रोटीओलाइटिक प्रक्रियेवर परिणाम करतात का.nsp7-11 पॉलीप्रोटीन रचनांचा संच nsp9 च्या N-टर्मिनसवर संबंधित प्रतिस्थापनांसह E. coli मध्ये तयार केला गेला आणि रीकॉम्बीनंट Mpro सह कापला गेला.Mpro-मीडिएटेड nsp8|9 क्लीवेज (किंवा इतर) मध्ये हस्तक्षेप करणार्‍या या प्रथिनांमधील संरचनात्मक बदलांना वगळून, चार साइट्सच्या (nsp9 फ्लॅंकिंग साइटसह) प्रोटीओलाइटिक क्लीवेज कोणत्याही सादर केलेल्या प्रतिस्थापनांमुळे (एसआय परिशिष्ट, आकृती S9) लक्षणीयरित्या प्रभावित होत नाही. संकेतस्थळ.
Huh-7 पेशी जीनोम-लांबीच्या HCoV-229E RNA द्वारे संक्रमित केल्या गेल्या, nsp9 N टर्मिनसवर संरक्षित NNE ट्रिपेप्टाइड्स (N3825, N3826, आणि E3827) मध्ये Ala किंवा Ser प्रतिस्थापन एन्कोडिंग केले गेले, बहुतेक उत्परिवर्तन घातक आहेत हे दर्शविते.N-टर्मिनल Asn (N2835A किंवा N2835S) चे Ser किंवा Ala बदलून आम्ही व्हायरसची सुटका करू शकलो, परंतु NNE क्रम (N3826A, N3826S, NN3825/6AA) मध्ये इतर एकल आणि दुहेरी उत्परिवर्तनांसह व्हायरस पुनर्प्राप्त करण्यात अयशस्वी झालो. NN3825/6SS) , E3827A) (आकृती 5D).
हे परिणाम सूचित करतात की टिश्यू कल्चरमध्ये कोरोनाव्हायरसची प्रतिकृती प्रतिबंधित (समान किंवा समान), शरीरातील nsp9 NMPylation साइट्सचे नैसर्गिक उत्परिवर्तन मर्यादित करते आणि कोरोनाव्हायरसच्या जीवन चक्रात या प्रतिसादाच्या मुख्य भूमिकेला समर्थन देते.
प्रयोगांच्या शेवटच्या संचामध्ये, आम्ही सी-टर्मिनल His6 लेबल केलेले SARS-CoV-2 nsp12 आणि nsp9, आणि E. coli मध्ये nsp12 चे दोन उत्परिवर्ती स्वरूप तयार केले.NiRAN आणि RdRp डोमेनमधील सक्रिय साइट अवशेष अनुक्रमे Ala वापरत होते (आकृती 6A आणि SI परिशिष्ट, टेबल S2).SARS-CoV-2 nsp12 मधील K4465 हे HCoV-229E (SI परिशिष्ट, आकृती S2) मधील K4135 शी संबंधित आहे, जे NiRAN क्रियाकलाप आणि HCoV-229E प्रतिकृती (आकृती 3D आणि E) साठी आवश्यक असल्याचे सिद्ध झाले आहे.हे अवशेष धमनी विषाणू EAV nsp9 K94 अवशेषांशी देखील संबंधित आहेत, जे पूर्वी NiRAN स्व-यूएमपीलेशन/सेल्फ-जीएमपीलायशन (16) साठी आवश्यक असल्याचे दर्शविले गेले होते.आकृती 6B मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, SARS-CoV-2 nsp12 मध्ये nsp9 चा सब्सट्रेट म्हणून UMP ट्रान्सफरेज क्रियाकलाप आहे, तर nsp12_K4465A सक्रिय साइट म्युटंट निष्क्रिय आहे.RdRp motif C च्या SDD वैशिष्ट्यपूर्ण अनुक्रमातील दुहेरी प्रतिस्थापन UMP ट्रान्सफरेज क्रियाकलाप (आकृती 6B) प्रभावित करत नाही, हे दर्शविते की RdRp क्रियाकलापाचा nsp9 UMPylation मध्ये थेट परिणाम होत नाही.CTP, GTP आणि ATP (SI परिशिष्ट, आकृती S10) वापरून समान डेटा प्राप्त केला गेला.सारांश, हे डेटा सूचित करतात की NiRAN-मध्यस्थ nsp9 NMPylation मध्ये ऑर्थोकोरोनाव्हायरस सबफॅमिलीच्या वेगवेगळ्या पिढीचे प्रतिनिधित्व करणाऱ्या कोरोनाव्हायरसमध्ये एक पुराणमतवादी क्रियाकलाप आहे.
SARS-CoV-2 nsp12-मध्यस्थ NMPylation of nsp9.(A) NMPylation चाचणीमध्ये वापरलेले रीकॉम्बीनंट प्रथिने दाखवणारे कूमासी स्टेन्ड एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल.नियंत्रण म्हणून, SARS-CoV-2 nsp12 च्या NiRAN डोमेन (K4465A) आणि RdRp डोमेन (DD5152/3AA) मध्ये सक्रिय साइट प्रतिस्थापन असलेले उत्परिवर्ती प्रोटीन वापरले गेले.अवशेष क्रमांकन pp1ab मधील स्थानावर आधारित आहे.(B) nsp9-His6 आणि [α-32P]UTP चा वापर करून nsp12-His6 (जंगली प्रकार [wt] आणि उत्परिवर्ती) च्या सब्सट्रेट म्हणून UMPylation डिटेक्शनचा ऑटोरेडिओग्राफ.लेबल केलेल्या प्रोटीनचे आण्विक वस्तुमान (किलोडाल्टन्समध्ये) डावीकडे दर्शविले आहे.
NiRAN डोमेन सामान्यत: Nidovirales (16) मध्ये संरक्षित केले जातात, हे दर्शविते की ते Nidovirus प्रतिकृतीसाठी आवश्यक एन्झाइमॅटिक प्रतिक्रिया उत्प्रेरित करतात.या अभ्यासात, आम्ही हे सिद्ध करू शकलो की कोरोनाव्हायरसचे NiRAN डोमेन NMP (NTP मधून तयार केलेले) nsp9 मध्ये हस्तांतरित करते, व्हायरस प्रतिकृतीमध्ये गुंतलेले एक रहस्यमय RNA बंधनकारक प्रोटीन (26?? 29), ते नैसर्गिक लक्ष्य म्हणून निर्धारित करण्यासाठी आणि कोरोनाव्हायरस RTC चा भागीदार.
NiRAN डोमेन तीन अनुक्रम स्वरूप (AN, BN, आणि CN) सामायिक करते, ज्यामध्ये अवशेषांची एक अतिशय कमी संख्या असते जी मोनोफिलेटिक परंतु उच्च भिन्नता असलेल्या निडोवायरेल्स ऑर्डरमध्ये सर्व कुटुंबांमध्ये संरक्षित केली जातात (8, 16).अलीकडील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की ते संरचनात्मकदृष्ट्या प्रथिने किनेज-सदृश प्रथिनांच्या मोठ्या प्रमाणात अनोळखी कुटुंबाशी संबंधित आहेत, ज्यांना मूळतः SelO कुटुंब (17, 19, 22, 30, 31) म्हणतात.SelO-संबंधित प्रथिनांमध्ये किनेज फोल्ड असतात, परंतु शास्त्रीय किनासेसमध्ये अनेक संरक्षित सक्रिय साइट अवशेष नसतात (22, 32).सक्रिय साइटवर बांधलेल्या आणि विशिष्ट परस्परसंवादांद्वारे स्थिर झालेल्या एटीपी रेणूंच्या रिव्हर्स ओरिएंटेशनच्या आधारावर, SelO ची कल्पना करण्यात आली आणि त्यानंतर AMP (फॉस्फेटऐवजी) प्रथिने सब्सट्रेट (22) मध्ये हस्तांतरित करण्याची पुष्टी केली गेली, तर आणखी एक जिवाणू SelO सारखी प्रथिने YdiU मध्ये आहे. अलीकडे Tyr आणि त्याच्या विविध प्रोटीन सब्सट्रेट्स (33) च्या UMP चे सहसंयोजक संलग्नक उत्प्रेरक असल्याचे दिसून आले आहे.
कोरोनाव्हायरस NiRAN डोमेनच्या सक्रिय साइट अवशेषांच्या अंदाजाची पुष्टी आणि विस्तार करण्यासाठी, आम्ही कोरोनाव्हायरस nsp12 (आकृती 3D आणि E आणि SI परिशिष्ट, आकृती S3 आणि सारणी) S1â वर उत्परिवर्तन विश्लेषण करण्यासाठी बायोकेमिकल आणि रिव्हर्स जेनेटिक्स पद्धती वापरल्या. S4).डेटा दर्शवितो की HCoV-229E K4135, R4178 आणि D4280 ची बदली Ala सह विट्रो NMP ट्रान्सफरेज क्रियाकलाप आणि सेल कल्चरमधील व्हायरस प्रतिकृती (आकृती 3D आणि E आणि SI परिशिष्ट, आकृती S3) काढून टाकते, NTP γ-फॉस्फेटमध्ये त्यांच्या उपस्थितीचे समर्थन करते. ( K4135, R4178) आणि सक्रिय साइट मेटल आयन (D4280) चे समन्वय.K4135 (17) स्थिती स्थिर ठेवण्याचा अंदाज असलेल्या पक्ष्यांच्या घरट्याच्या विषाणूच्या श्रेणीतील संरक्षित ग्लूचा E4145A प्रतिस्थापन विषाणूजन्य प्रतिकृती काढून टाकण्यासाठी दर्शविण्यात आला, परंतु आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, इन विट्रो NMPylation परख (आकृती 3D आणि E आणि) मध्ये ही क्रिया कायम ठेवण्यात आली. SI परिशिष्ट, आकृती S3 आणि तक्ते S1–S4).साल्मोनेला टायफिमुरियम (E130A) (33) च्या YdiU homolog मध्ये संबंधित प्रतिस्थापन सादर केले गेले तेव्हा असेच निरीक्षण केले गेले.एकत्रितपणे, हे डेटा उत्प्रेरक कार्याऐवजी या संरक्षित अवशेषांच्या नियामक कार्यास समर्थन देतात.
HCoV-229E NiRAN डोमेन (8) मधील नेस्टोव्हायरसच्या मर्यादेत संरक्षित Phe अवशेष (F4281A) पुनर्स्थित केल्याने विट्रोमध्ये NMPylation क्रियाकलाप कमी झाला आणि सेल कल्चरमध्ये विषाणूच्या प्रतिकृतीमध्ये लक्षणीय घट झाली (चित्र 3D, E आणि SI) परिशिष्ट, आकृती S3).डेटा या अवशेषांच्या महत्त्वाच्या नियामक कार्याशी सुसंगत आहे, जसे की पूर्वी दर्शविलेले समरूप DFG मोटिफ Phe अवशेष.शास्त्रीय प्रोटीन किनेसेसमध्ये, हे Mg2+ बंधनकारक लूपचा भाग आहे आणि मणक्याचे एकत्रीकरण आणि नियमन करण्यास मदत करते???प्रभावी उत्प्रेरक क्रियाकलाप (32, 34) साठी आवश्यक आहे.K4116 अवशेषांसाठी Ala आणि Arg ची जागा (preAN motif मध्ये), अनुक्रमे, विषाणूची प्रतिकृती काढून टाकली आणि अपेक्षेप्रमाणे, विट्रोमधील NMP ट्रान्सफरेज क्रियाकलापावर वेगवेगळे परिणाम झाले, हे अमीनो ऍसिड साइड चेनवर अवलंबून आहे (आकृती 3D आणि E आणि SI परिशिष्ट , आकृती S3).कार्यात्मक डेटा संरचनात्मक माहितीशी सुसंगत आहे, हे दर्शविते की या अवशेषाने एटीपी फॉस्फेट (17) सह परस्परसंवाद स्थापित केला आहे.इतर नेस्टेड विषाणू कुटुंबांच्या NiRAN डोमेनमध्ये, HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 चे स्थान Lys, Arg किंवा His (8) द्वारे व्यापलेले आहे, हे सूचित करते की या विशिष्ट अवशेषांचे कार्यात्मक निर्बंध शिथिल केले गेले आहेत.D4188A आणि D4283A ची बदली एन्झाइमची क्रिया काढून टाकते किंवा जोरदारपणे कमी करते आणि व्हायरसची प्रतिकृती काढून टाकते (आकृती 3).हे दोन अवशेष बहुतेक (परंतु सर्वच नाही) नेस्टेड व्हायरस (8) मध्ये संरक्षित केले जातात, जे एक महत्त्वाचे कुटुंब-विशिष्ट परंतु शक्यतो गैर-उत्प्रेरक कार्य दर्शवतात.इतर अनेक Lys आणि Asp अवशेषांचे (K4113A, D4180A, D4197A आणि D4273A) Ala प्रतिस्थापन जे कोरोनाविरिडे किंवा इतर नेस्टिओव्हिरिडे कुटुंबांमध्ये संरक्षित नाहीत (8) नियंत्रण म्हणून वापरले गेले.अपेक्षेप्रमाणे, काही प्रकरणांमध्ये एन्झाइम क्रियाकलाप आणि विषाणूजन्य प्रतिकृतीमध्ये किंचित घट होऊन (आकृती 3 आणि SI परिशिष्ट, आकृती S3) हे प्रतिस्थापन मोठ्या प्रमाणात सुसह्य आहेत.एकूणच, कोरोनाव्हायरस म्युटाजेनेसिस डेटा EAV NiRAN-RdRp (16) च्या सेल्फ-जीएमपी आणि रिव्हर्स जेनेटिक्स डेटाशी अगदी सुसंगत आहे, ज्यामध्ये EAV nsp9 (कोरोनाव्हायरस nsp12 ऑर्थोलॉज) अवशेष K94 (HCoV- 229E K4135 शी संबंधित), महत्त्वपूर्ण कार्ये आहेत. R124 (R4178 शी संबंधित), D132 (D4188 शी संबंधित), D165 (D4280 शी संबंधित), F166 (F4281 शी संबंधित).याशिवाय, HCoV-229E म्युटाजेनेसिस डेटा पूर्वी नोंदवलेल्या SARS-CoV रिव्हर्स जेनेटिक्स डेटा (16) शी सुसंगत आणि विस्तारित आहे, अगदी संबंधित CN motif Phe-to-Ala म्युटंट SARS-CoV_nsp12 द साठी निरीक्षण केलेल्या प्रमाणेच. वर्णन केलेले फेनोटाइप -F219A आणि HCoV-229E_F4281A (आकृती 3 डी आणि ई आणि एसआय परिशिष्ट, आकृती S3 आणि टेबल S1-S4).
EAV ऑर्थोलॉज (16) च्या तुलनेत, ज्यांना UTP आणि GTP (स्वयं-NMPylation प्रतिक्रियामध्ये) स्पष्ट प्राधान्य आहे, आमचा अभ्यास दर्शवितो की कोरोनाव्हायरस NiRAN डोमेन (HCoV-229E आणि SARS-CoV-2 द्वारे प्रस्तुत) प्रभावीपणे होऊ शकते. सर्व चार NMPs हस्तांतरित केले, जरी UMP साठी थोडेसे प्राधान्य आहे (आकडे 1 आणि 3).विशिष्ट NTP सह-सबस्ट्रेटची तुलनेने कमी विशिष्टता नुकत्याच नोंदवलेल्या SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 सुपरकंपोझिट स्ट्रक्चरशी सुसंगत आहे, ज्यामध्ये ADP-Mg2+ NiRAN च्या सक्रिय साइटशी जोडलेले आहे, परंतु एडिनाइन भागासह नाही. विशिष्ट परस्परसंवादाच्या निर्मितीचे (17).आमच्या अभ्यासात, NMPylation प्रतिक्रियामध्ये वापरल्या जाणार्‍या न्यूक्लियोटाइडच्या प्रकाराचा उत्परिवर्ती प्रथिने (SI परिशिष्ट, आकृती S3) च्या क्रियाकलापांवर कोणताही भिन्न प्रभाव पडत नाही, हे दर्शविते की यापैकी कोणतेही अवशेष विशिष्ट न्यूक्लियोबेसच्या बंधनाशी जवळून संबंधित नाहीत.कोरोनाव्हायरस आणि धमनी विषाणूंच्या NiRAN डोमेनमध्ये आढळलेल्या विविध NTP सह-सबस्ट्रेट प्राधान्यांचा संरचनात्मक आधार आणि संभाव्य जैविक महत्त्व अभ्यासणे बाकी आहे;ते खरे असू शकतात किंवा त्यांच्या संबंधित अभ्यासाच्या मर्यादांमुळे असू शकतात.सध्या, हे नाकारता येत नाही की धमनी विषाणू NiRAN डोमेनच्या संभाव्य NMPylator क्रियाकलापांना (पूर्वी वैशिष्ट्यीकृत स्व-NMPylation क्रियाकलापांच्या तुलनेत) भिन्न सह-सबस्ट्रेट प्राधान्य आहे, हे लक्षात घेऊन धमनी आणि कोरोनाव्हायरसमधील समानता. NiRAN डोमेन त्याच्या मर्यादेवर आहे.अनुक्रम-आधारित तुलना (16).कोफॅक्टर म्हणून Mg2+ वापरणार्‍या स्यूडोकिनेज SelO च्या तुलनेत, कोरोनाव्हायरस आणि धमनी विषाणू NiRAN ची क्रिया Mn2+ (16) वर अवलंबून आहे (आकृती 3C आणि SI परिशिष्ट, आकृती S1).Mn2+ अवलंबित्व आणि UTP साठी स्पष्ट प्राधान्य हे प्रोटीन NMPylators चे एक असामान्य वैशिष्ट्य आहे, आणि अलीकडेच साल्मोनेला टायफिमुरियमच्या YdiU प्रोटीनमध्ये पुष्टी झाली आहे, जे तणाव प्रेरण सेल एटीपी पूल (सेल एटीपी पूल) पासून पेशींचे संरक्षण करण्यासाठी कठोर Mn2+-आश्रित प्रोटीन चेपेरोन UMPylation चे उत्प्रेरक करते. ३३).
कोरोनाव्हायरस NiRAN डोमेन आणि सेल्युलर प्रोटीन किनेसेस (17, 19) मधील अलीकडे वर्णन केलेली संरचनात्मक समानता NiRAN च्या NMP ला या अभ्यासात नोंदवलेल्या इतर प्रथिनांशी सहसंयोजितपणे जोडण्याच्या क्षमतेसाठी अतिरिक्त समर्थन प्रदान करते.आम्ही आमचा शोध HCoV-229E ORF1a द्वारे एन्कोड केलेल्या प्रथिनांवर संभाव्य NiRAN लक्ष्यांवर केंद्रित केला, जे RTC च्या ORF1b-एनकोड केलेल्या प्रतिकृतीला प्रत्यक्ष किंवा अप्रत्यक्षपणे मदत करण्यासाठी ओळखले जातात (12, 35).आमचे प्रयोग nsp9 च्या प्रभावी आणि विशिष्ट NMPylation साठी निर्णायक पुरावे देतात (आकृती 2).एंझाइम (nsp12) पेक्षा 8 ते 10 पटीने जास्त असलेल्या दाढीमध्ये लक्ष्य प्रथिने वापरल्यास, nsp9 पूर्णपणे (मोनो) NMPized (आकृती 4) असल्याची पुष्टी होते.आम्ही असा निष्कर्ष काढला की nsp12 आणि nsp9 मधील परस्परसंवाद अल्पकालीन आहे आणि nsp9 (इतर RTC सबयुनिट्सच्या अनुपस्थितीत) सह स्थिर कॉम्प्लेक्स तयार करणार नाही.हा निष्कर्ष SARS-CoV प्रोटीओम (35) वर प्रथिने परस्परसंवाद अभ्यासाद्वारे समर्थित आहे.MS विश्लेषणाने nsp9 च्या N-टर्मिनल अवशेषांचे प्राथमिक अमाइन NMPylation साइट (SI परिशिष्ट, आकृती S5) म्हणून ओळखले.फॉस्फोरामीडेट बाँड आणि एन-टर्मिनल एमिनो ग्रुपची निर्मिती NiRAN-मध्यस्थ NMPylation क्रियाकलाप स्यूडोमोनास सिरिंज SelO-मध्यस्थ एएमपीलेशन प्रतिक्रिया पासून वेगळे करते, जे Ser, Thr, किंवा Tyr अवशेष (पेप्टाइड ऍडक्टेड ऍडक्ट) येथे O-लिंक्ड एएमपीच्या निर्मितीला उत्प्रेरित करते. 22), आणि S. टायफिमुरियम YdiU ओ-लिंक्ड (टायरसह) आणि एन-लिंक्ड (त्याच्यासह) पेप्टाइड-यूएमपी अॅडक्ट बनवते.प्रथिनांच्या SelO कुटुंबावर उपलब्ध मर्यादित माहिती दर्शवते की या मोठ्या प्रथिने कुटुंबातील सदस्य पेप्टाइड-NMP ऍडक्ट्सच्या निर्मितीमध्ये खूप भिन्न आहेत.हे एक मनोरंजक निरीक्षण आहे जे पुढील अभ्यासास पात्र आहे.
या अभ्यासात मिळालेल्या डेटाने आम्हाला असे गृहित धरले की nsp9 च्या NMPylation साठी विनामूल्य N-टर्मिनस आवश्यक आहे.व्हायरल प्रतिकृतीच्या संदर्भात, हे Mpro आणि pp1ab द्वारे मध्यस्थी केलेल्या प्रतिकृती पॉलीप्रोटीन pp1a मधील nsp8|nsp9 प्रक्रिया साइटच्या प्रोटीओलाइटिक क्लीवेजद्वारे प्रदान केले जाईल.बहुतेक कोरोनाव्हायरसमध्ये, या विशिष्ट साइटमध्ये (VKLQ|NNEI HCoV-229E) आणि इतर सर्व कोरोनाव्हायरस एमप्रो क्लीव्हेज साइट्समधील फरक Asn (अला, सेर किंवा ग्लाय सारख्या इतर लहान अवशेषांऐवजी) P1â व्यापतात???स्थान (36).सुरुवातीच्या अभ्यासात मिळालेल्या पेप्टाइड क्लीव्हेज डेटावरून असे दिसून आले आहे की nsp8|nsp9 साइटची क्लीवेज कार्यक्षमता इतर साइट्सपेक्षा कमी होती, हे सूचित करते की 1) सी-टर्मिनलच्या वेळेवर समन्वयित प्रक्रियेमध्ये या विशिष्ट साइटची नियामक भूमिका असू शकते. pp1a प्रदेश, किंवा 2) विषाणू प्रतिकृतीमध्ये विशेष संरक्षित एनएसपी9 एन-टर्मिनसची भूमिका (37).आमचा डेटा (आकृती 5A) दर्शवितो की वास्तविक N-टर्मिनल अनुक्रम वाहून नेणारा nsp9 चे रीकॉम्बिनंट फॉर्म प्रभावीपणे nsp12 द्वारे NMPीकृत होते.एन-टर्मिनल फ्लॅंकिंग अनुक्रम फॅक्टर Xa (nsp9-His6; SI परिशिष्ट, टेबल S1) किंवा Mpro-मध्यस्थ क्लीवेज (nsp7-11-His6; आकृती 5A आणि SI परिशिष्ट, टेबल S1) द्वारे काढला गेला.महत्त्वाचे म्हणजे, न कापलेले nsp9-युक्त पूर्ववर्ती nsp7-11-His6 ने nsp12 च्या NMPylation ला प्रतिकार दर्शविला, जो आमच्या डेटाशी सुसंगत आहे, हे दर्शविते की nsp9-NMP व्यसन N-टर्मिनल प्राथमिक अमाइन (SI परिशिष्ट, आकृती S5) द्वारे तयार होते. .NiRAN सब्सट्रेट विशिष्‍टतेची सखोल माहिती मिळवण्‍यासाठी, आम्ही नंतर nsp9 च्या शेजारील N-टर्मिनल अवशेषांवर लक्ष केंद्रित केले.इतर प्रथिनांच्या अनुपस्थितीत, ते संरचनात्मकदृष्ट्या लवचिक असतात, त्यांना nsp9 (26 28, 38) च्या लेबल नसलेल्या स्वरूपात आढळून येण्यापासून प्रतिबंधित करतात, त्यांच्या मर्यादित नैसर्गिक भिन्नता दर्शवितात, हे महत्त्वपूर्ण अनुक्रम-विशिष्ट (दुय्यम संरचना संबंधित नाही) मुळे आहे. nsp9 N-टर्मिनल फ्रॅगमेंटचे कार्य.या प्रदेशातील संरक्षित अवशेषांच्या Ala प्रतिस्थापना (आकृती 5C आणि D आणि SI परिशिष्ट, आकृती S8) हे उघड करतात की N3826 विट्रोमध्ये nsp9 NMPylation साठी आवश्यक आहे, तर N3825A आणि E3827A प्रतिस्थापनांमुळे NMPylation मध्ये घट होते, तर P389 A substitutions P3820 नाही. .स्पष्टपणे nsp9 NMPylation वर परिणाम होतो.N-टर्मिनल Asn (N3825A, N3825S) च्या प्रतिस्थापनाचा nsp9 NMPylation आणि सेल कल्चर (आकृती 5C आणि D) मधील विषाणू प्रतिकृतीवर केवळ मध्यम प्रभाव असला तरी, N-टर्मिनल 3825-NN dipe मधून Asn अवशेषांचा क्रम हटवला जातो. हे व्हायरससाठी प्राणघातक असल्याचे सिद्ध झाले आहे, हे दर्शविते की एन-टर्मिनसवर दुसर्या अवशेषांपूर्वी एक Asn अवशेष आवश्यक आहे, शक्यतो Asn, जरी असे दिसते की समान अवशेषांचे प्रतिस्थापन अंशतः सहन केले जाऊ शकते (आकृती 5B, C, आणि D).आम्ही असा निष्कर्ष काढतो की 3825-NN डायपेप्टाइड, विशेषतः संरक्षित आणि आवश्यक N3826 अवशेष कोरोनाव्हायरस श्रेणीतील (SI परिशिष्ट, आकृती S6), NiRAN च्या सक्रिय साइटमध्ये nsp9 N-टर्मिनसचे योग्य बंधन आणि अभिमुखता सुनिश्चित करते.
सर्व उपकुटुंबांच्या संरक्षित ग्लूसाठी Ala (E3827A) ची जागा बदलणे विट्रोमध्ये nsp9 NMPylation राखून ठेवते परंतु सेल कल्चर (आकृती 5C आणि D) मधील विषाणूंसाठी घातक आहे, या अवशेषांचे अतिरिक्त कार्य दर्शवते, उदाहरणार्थ, मुख्य संवादांमध्ये (NMPylated किंवा unmodified) ) nsp9 N-टर्मिनस आणि व्हायरसच्या प्रतिकृतीमध्ये गुंतलेले इतर घटक.Nsp9 उत्परिवर्तनांचा nsp9 च्या प्रोटीओलाइटिक प्रक्रियेवर किंवा कोणत्याही लगतच्या nsps (39) (SI परिशिष्ट, आकृती S9) वर परिणाम झाला नाही, हे दर्शविते की अनेक nsp9 उत्परिवर्तनांचे प्राणघातक फिनोटाइप C proteolytic प्रक्रिया-टर्मिनल pp1a क्षेत्राच्या डिसरेग्युलेशनमुळे झाले नाहीत. .
वरील डेटा पुरावा देतो की pp1a/pp1ab मधील nsp8|9 क्लीवेज साइटच्या Mpro-मध्यस्थ उपचारानंतर, nsp9 चे N-टर्मिनस UMPylated (किंवा दुसर्या NMP सह अंशतः सुधारित) केले जाऊ शकते.याव्यतिरिक्त, nsp9 च्या N-टर्मिनसचे उत्कृष्ट संवर्धन (कोरोनाव्हायरस कुटुंबातील एकवचन आणि अपरिवर्तनीय Asn अवशेषांसह) आणि या अभ्यासात मिळालेल्या उलट अनुवांशिक डेटा (आकडे 3E आणि 5D) मुळे आम्हाला असा निष्कर्ष काढता आला की वर्णन केलेले nsp9 NMPylation जैविकदृष्ट्या संबंधित आहे आणि कोरोनाव्हायरस प्रतिकृतीसाठी आवश्यक आहे.या सुधारणेचे कार्यात्मक परिणाम अभ्यासणे बाकी आहे, उदाहरणार्थ, पूर्वी वर्णन केलेल्या (नॉन-विशिष्ट) nsp9 (अपरिवर्तित फॉर्म) RNA बंधनकारक क्रियाकलाप (2628) संबंधित.एन-टर्मिनल NMPylation प्रथिने किंवा RNA सब्सट्रेट्ससह nsp9 च्या परस्परसंवादावर किंवा वेगवेगळ्या चार-स्तरीय असेंब्लीच्या निर्मितीवर देखील परिणाम करू शकते.हे स्ट्रक्चरल अभ्यासांमध्ये आढळून आले आहे आणि कोरोनाव्हायरस प्रतिकृतीशी कार्यात्मकपणे संबंधित असल्याची पुष्टी केली गेली आहे, जरी विशेषत: या बदलाच्या बाबतीत (26- ââ29, 40) च्या अनुपस्थितीत.
जरी कोरोनाव्हायरस NiRAN डोमेनची लक्ष्य विशिष्टता अद्याप अधिक तपशीलवार वर्णन करणे आवश्यक आहे, तरीही आमचा डेटा असे दर्शवितो की कोरोनाव्हायरस NiRAN डोमेनची प्रथिने लक्ष्य विशिष्टता खूपच अरुंद आहे.जरी सर्व निडोव्हायरस कुटुंबांच्या NiRAN डोमेनमधील प्रमुख सक्रिय साइट अवशेषांचे (8, 16) संवर्धन या प्रथिनांच्या संरक्षित NMPylator च्या क्रियाकलापांना जोरदार समर्थन देत असले तरी, या डोमेनच्या सब्सट्रेट बंधनकारक पॉकेट अवशेषांची ओळख संवर्धन आणि संवर्धन वैशिष्ट्यीकृत करणे बाकी आहे. , आणि Nidovirales उद्देशांच्या भिन्न कुटुंबांमध्ये भिन्न असू शकतात.त्याचप्रमाणे, इतर नेस्टेड व्हायरसचे संबंधित लक्ष्य अद्याप निश्चित केले गेले नाहीत.ते nsp9 किंवा इतर प्रथिनांचे रिमोट ऑर्थोलॉग्स असू शकतात, कारण साधारणपणे नेस्टेड व्हायरसमध्ये संरक्षित केलेल्या पाच प्रतिकृती डोमेनच्या बाहेरील अनुक्रम कमी संरक्षित आहेत (8), ज्यामध्ये Mpro आणि NiRAN मधील जीनोम अॅरे समाविष्ट आहेत, त्यापैकी, nsp9 मध्ये स्थित आहे. कोरोना विषाणू.
याव्यतिरिक्त, NiRAN डोमेनमध्ये अतिरिक्त (सेल्युलरसह) लक्ष्य असण्याची शक्यता आम्ही सध्या नाकारू शकत नाही.या प्रकरणात, हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की या उदयोन्मुख प्रोटीन NMPylators (NMPylators) (30, 31) मधील बॅक्टेरियल होमोलोग्समध्ये "मास्टर रेग्युलेटर" आहेत?एनएमपी विविध सेल्युलर प्रथिने त्यांच्या डाउनस्ट्रीम क्रियाकलापांचे नियमन करण्यासाठी किंवा काढून टाकण्यासाठी मोड्युलेट करते, ज्यामुळे सेल्युलर तणाव प्रतिसाद आणि रेडॉक्स होमिओस्टॅसिस (22, 33) सारख्या विविध जैविक प्रक्रियांमध्ये भूमिका बजावते.
या अभ्यासात (आकडे 2 आणि 4 आणि SI परिशिष्ट, आकृती S3 आणि S5), आम्ही हे सिद्ध करू शकलो की nsp12 ने UMP (NMP) भाग nsp9 मध्ये एका (संरक्षित) स्थितीत हस्तांतरित केला, तर इतर प्रथिने nsp9 मध्ये बदलली नाहीत. वापरलेल्या परिस्थितीत, चांगल्या-परिभाषित (सैल ऐवजी) सब्सट्रेट विशिष्टता समर्थित आहे.याच्याशी सुसंगत, N-टर्मिनल nsp9 NMPylation च्या तुलनेत, nsp12 ची स्वतःची NMPylation क्रियाकलाप खूप कमी आहे, त्याच्या शोधासाठी ऑटोरेडिओग्राफी एक्सपोजर वेळ आवश्यक आहे, आणि nsp12 एकाग्रतेमध्ये 10 पट वाढ वापरली जाते.याव्यतिरिक्त, आमचे MS विश्लेषण nsp12 च्या NMPylation साठी पुरावे प्रदान करण्यात अयशस्वी झाले, जे सूचित करते की NiRAN डोमेन स्व-NMPylation (सर्वोत्तम) एक दुय्यम क्रियाकलाप आहे.तथापि, हे लक्षात घ्यावे की इतर अभ्यासांनी प्राथमिक पुरावे प्रदान केले आहेत की जिवाणू NMPylator ची स्वयं-AMPylation स्थिती इतर प्रोटीन सब्सट्रेट्स (22, 33) वर त्यांची NMPylation क्रियाकलाप नियंत्रित करू शकते.म्हणून, C-टर्मिनल RdRp डोमेनच्या फोल्डिंगवर प्रस्तावित शॅपरोन-सदृश प्रभावासह, EAV nsp9 (16) आणि कोरोनाव्हायरस nsp12 (हा अभ्यास) साठी नोंदवलेल्या स्व-NMPylation क्रियाकलापांच्या संभाव्य कार्यात्मक प्रभावांची तपासणी करण्यासाठी अधिक संशोधन आवश्यक आहे. १६)).
यापूर्वी, निडोव्हायरल NiRAN डोमेनच्या संभाव्य डाउनस्ट्रीम फंक्शन्सबाबत अनेक गृहितकांचा विचार केला गेला आहे, ज्यामध्ये RNA ligase, RNA-capped guanylate transferase आणि प्रोटीन प्राइमिंग क्रियाकलाप (16), परंतु त्यापैकी कोणतीही उपलब्ध डाउनस्ट्रीम फंक्शन्सशी सुसंगत नाही.खालील पोझिशन्समध्ये प्राप्त केलेली माहिती अतिरिक्त गृहीत न धरता अगदी त्याच वेळी आहे.या अभ्यासात मिळालेला डेटा प्रथिने-प्रेरित आरएनए संश्लेषणाच्या आरंभामध्ये NiRAN डोमेनचा सहभाग आहे हे सर्वात सुसंगत आहे (परंतु सिद्ध करू शकत नाही).पूर्वी असे मानले जात होते की 5 मध्ये NiRAN डोमेनचे कार्य?²-RNA कॅपिंग किंवा RNA लिगेशन प्रतिक्रियांवर या आणि इतर डेटाच्या समर्थनाचा परिणाम होत नाही.म्हणून, उदाहरणार्थ, NiRAN च्या सक्रिय साइटमध्ये सामान्य आधार म्हणून संरक्षित Asp समाविष्ट असल्याचे मानले जाते (स्यूडोमोनास सिरिंगा SelO मध्ये D252; HCoV-229E pp1ab मध्ये D4271; SARS-CoV-2 nsp12 मध्ये D208) (SI परिशिष्ट, आकृती 2 ).S2) (17, 22, 33), तर ATP-आश्रित RNA ligase आणि RNA कॅपिंग एंझाइममधील उत्प्रेरक कोव्हॅलेंट एन्झाइम-(lysyl-N)-NMP इंटरमीडिएटद्वारे चालते, ज्यामध्ये न बदललेले Lys अवशेष समाविष्ट असतात ( ४१).याव्यतिरिक्त, संरक्षित प्रोटीन लक्ष्यांसाठी कोरोनाव्हायरस NiRAN ची उल्लेखनीय अनुक्रम-आधारित विशिष्टता आणि NTP सह-सबस्ट्रेट्ससाठी आरामशीर विशिष्टता (UTP पसंत करते) NiRAN-मध्यस्थ कॅपिंग एन्झाइम किंवा RNA ligase-सारख्या कार्यांना विरोध करते.
साहजिकच, पुष्कळ अतिरिक्त कामाची पडताळणी करणे आवश्यक आहे आणि, सिद्ध झाल्यास, प्रथिने-प्रेरित आरएनए संश्लेषणामध्ये nsp9-UMP (nsp9-NMP) ची संभाव्य भूमिका स्पष्ट करा, जे अनेक मनोरंजक परंतु (आतापर्यंत) पूर्वी नोंदवलेले अहवाल जोडतील. .अलिप्त निरीक्षणे.उदाहरणार्थ, हे निश्चित केले गेले आहे की कोरोनाव्हायरसच्या नकारात्मक-स्ट्रँड आरएनएचा शेवट ऑलिगो(यू) स्ट्रँडने सुरू होतो (42, 43).हे निरीक्षण या कल्पनेशी सुसंगत आहे की नकारात्मक-स्ट्रँड RNA चे संश्लेषण nsp9 चे UMPylated फॉर्म पॉली(A) टेल ( ट्रिगर्स) ला बांधून सुरू केले जाते, ज्याला त्याच्या RNA बंधनकारक क्रियाकलाप आणि/किंवा परस्परसंवादाद्वारे प्रोत्साहन दिले जाऊ शकते. आणखी एक RTC प्रोटीन.nsp9 द्वारे प्रदान केलेला UMP भाग नंतर nsp7/8/nsp12-मध्यस्थ ऑलिगॉरिडायलेशनसाठी "प्राइमर" म्हणून वापरला जाऊ शकतो, जीनोमिक RNA मधील 3??²-पॉली(A) शेपटी किंवा आणखी एक ऑलिगो (A)-युक्त अनुक्रम वापरून पिकोर्नाव्हायरस व्हीपीजी प्रोटीन (44) साठी स्थापित केलेल्या यंत्रणेप्रमाणेच टेम्पलेट म्हणून कार्य करते.प्रस्ताव "नॉन-ऑर्डरिटीव्ह" असल्यास काय????(प्रोटीन-प्रेरित) नकारात्मक-स्ट्रँड आरएनए संश्लेषणाची सुरुवात निरीक्षणांना एक दुवा प्रदान करते, जे सूचित करते की कोरोनाव्हायरस नकारात्मक-स्ट्रँड आरएनएच्या शेवटी (42) यूएमपी (यूटीपी ऐवजी) आहे, जे सूचित करते असे मानले जाते की nucleic acid Dicer अज्ञात uridine-विशिष्ट एंडोन्यूक्लीज द्वारे फॉस्फोरिलेटेड शेवटचा भाग कापतो.पुष्टी झाल्यास, ही न्यूक्लिक अॅसिड हायड्रोलाइटिक क्रियाकलाप nsp9 चे ऑलिगोमेरिक UMPylated फॉर्म नवजात नकारात्मक स्ट्रँडच्या 5 ² टोकापासून सोडण्यास मदत करू शकते.प्रथिने प्राइमिंगमध्ये nsp9 ची संभाव्य भूमिका मागील रिव्हर्स जेनेटिक्स अभ्यासांशी सुसंगत आहे, ज्याने दर्शविले आहे की nsp9 (आणि nsp8) कोरोनाव्हायरस जीनोमच्या 3 शेवटच्या जवळ संरक्षित cis-अभिनय RNA घटकाशी गंभीरपणे आणि विशेषतः संवाद साधतात.४५).या अहवालानुसार, ही पूर्वीची निरीक्षणे आता पुन्हा तपासली जाऊ शकतात आणि पुढील संशोधनाद्वारे त्यांचा विस्तार केला जाऊ शकतो.
सारांश, आमच्या डेटाने N-टर्मिनसवर RdRp शी लिंक केलेल्या प्रोप्रायटरी नेस्टेड व्हायरस एन्झाइम टॅगची विशिष्ट क्रिया निर्धारित केली.कोरोनाव्हायरसमध्ये, या नव्याने सापडलेल्या NiRAN-मध्यस्थ UMPylator/NMPylator क्रियाकलापाचा उपयोग Mn2+ आणि जवळच्या Asn अवशेषांवर अवलंबून राहण्यासाठी केला जातो आणि N-टर्मिनल प्राथमिक अमाइनसह (कमी-ऊर्जा) फॉस्फोरामीडेट बाँड तयार होतो.nsp8|9 क्लीवेज साइटवर Mpro-मध्यस्थ क्लीवेजद्वारे, nsp9 लक्ष्य NMPylation साठी वापरले जाऊ शकते, जे प्रोटीज आणि NiRAN डोमेन दरम्यान कार्यात्मक जोड दर्शवते, जे RdRp पर्यंत विस्तारित आहे.nsp12 NiRAN सक्रिय साइटमधील मुख्य अवशेषांचे संवर्धन आणि nsp9 लक्ष्य, SARS-CoV-2 सह दोन कोरोनाव्हायरसमधून मिळवलेल्या डेटासह एकत्रितपणे, nsp9 NMPylation हा एक कोरोनाव्हायरस आहे याचा भक्कम पुरावा प्रदान करतो कंझर्व्हेटिव्ह वैशिष्ट्ये देखील व्हायरस प्रतिकृतीमध्ये एक महत्त्वाची पायरी आहे.उपलब्ध डेटा आम्हाला निष्कर्षापर्यंत पोहोचवतो की प्रथिने-प्रेरित RNA संश्लेषणात NMP9 च्या NMPylated फॉर्मची विशिष्ट भूमिका कोरोनाव्हायरस आणि इतर नेस्टेड व्हायरससाठी एक वाजवी परिस्थिती आहे आणि NiRAN इतर अज्ञात प्रथिनांना देखील लक्ष्य करू शकते.व्हायरसचे नियमन करा.होस्ट संवाद.पुष्टी झाल्यास, व्हायरल RNA संश्लेषणामध्ये प्रोटीन प्राइमर्सचा सहभाग Mpro/3CLpro आणि RdRp डोमेनची अनुक्रमे आत्मीयता वाढवेल पूर्वी सापडलेल्या कोरोनाव्हायरस आणि पिकोर्नाव्हायरस सारख्या सुपरग्रुप (9), जे आता अलीकडेच स्थापित पिसोनिव्हिराइट्समध्ये एकत्र केले गेले आहेत. 46) श्रेणीत.
आमचा डेटा देखील दर्शवितो की या अभ्यासात ओळखल्या गेलेल्या मूलभूत, निवडक आणि पुराणमतवादी एन्झाइम क्रियाकलापांचा वापर अँटीव्हायरल औषधांसाठी लक्ष्य म्हणून केला जाऊ शकतो.NiRAN च्या सक्रिय साइटमध्ये संरक्षित nsp9 N-टर्मिनसच्या बंधनात (आणि त्यानंतरच्या बदलामध्ये) व्यत्यय आणणारी संयुगे प्रभावी आणि बहुमुखी अँटीव्हायरल औषधांमध्ये विकसित केली जाऊ शकतात, जी भिन्न (उप) वंशातील संसर्गापासून प्राणी आणि मानवी कोरोनाव्हायरसच्या उपचारांसाठी उपयुक्त आहेत. , SARS-CoV-2 आणि मिडल ईस्ट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोनाव्हायरस.
या अभ्यासात तयार केलेल्या कोरोनाव्हायरस प्रोटीनचा कोडिंग क्रम RT-PCR द्वारे HCoV-229E संक्रमित Huh-7 किंवा SARS-CoV-2 ची लागण झालेल्या Vero E6 मधून विलग केलेला RNA वापरून वाढविण्यात आला आणि मानक क्लोनिंग प्रक्रियेचा वापर करून घातला गेला.pMAL-c2 (न्यू इंग्लंड बायोलॉजिकल लॅबोरेटरी) किंवा PASK3-Ub-CHis6 (47) एक्सप्रेशन वेक्टर (SI परिशिष्ट, टेबल्स S1 आणि S2).पीसीआर-आधारित साइट-निर्देशित म्युटाजेनेसिस (48) द्वारे सिंगल कोडॉन प्रतिस्थापन सादर केले गेले.MBP फ्यूजन प्रोटीन तयार करण्यासाठी, E. coli TB1 पेशी योग्य pMAL-c2 प्लास्मिड कंस्ट्रक्ट (SI परिशिष्ट, टेबल S1) सह रूपांतरित करण्यात आल्या.फ्यूजन प्रोटीन अॅमायलोज अॅफिनिटी क्रोमॅटोग्राफीद्वारे शुद्ध केले गेले आणि फॅक्टर Xa सह क्लीव्ह केले गेले.त्यानंतर, C-टर्मिनल हिस6-टॅग केलेले प्रथिने पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे Ni-immobilized मेटल ऍफिनिटी क्रोमॅटोग्राफी (Ni-IMAC) द्वारे शुद्ध केले गेले (49).ubiquitin फ्यूजन प्रोटीन तयार करण्यासाठी, E. coli TB1 पेशींनी योग्य paSK3-Ub-CHis6 प्लास्मिड कंस्ट्रक्ट (SI परिशिष्ट, टेबल्स S1 आणि S2) आणि pCGI प्लास्मिड DNA एन्कोडिंग ubiquitin-विशिष्ट C-टर्मिनल हायड्रोलेज 1 (Ubp1) वापरले.परिवर्तन (47).सी-टर्मिनल His6-टॅग केलेले कोरोनाव्हायरस प्रोटीन पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे शुद्ध केले गेले (50).
HCoV-229E nsp12-His6 ची स्वयं-NMPylation चाचणी EAV nsp9 (16) मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे केली गेली.थोडक्यात, nsp12-His6 (0.5 µM) मध्ये 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, buffate, 25mm निर्दिष्ट NTP आणि 0.17 µM जुळले [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) 30 °C वर 30 मिनिटांसाठी.nsp12-मध्यस्थ nsp9 NMPylation च्या इतर सर्व (मानक) NMPylation assays मध्ये, प्रतिक्रिया परिस्थिती खालीलप्रमाणे समायोजित केल्या जातात: nsp12-His6 (0.05 µM) आणि nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (pH08) च्या उपस्थितीत. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM सूचित NTP, आणि 0.17 µM जुळलेले [α32-P]NTP.30°C वर 10 मिनिटे उष्मायन केल्यानंतर, प्रतिक्रिया नमुना SDS-PAGE नमुना बफरमध्ये मिसळला गेला: 62.5 mM tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% ग्लिसरॉल आणि 0.005% ब्रोफेन निळा90 °C वर 5 मिनिटे गरम करून प्रथिने विकृत केले गेले आणि 12% SDS-PAGE ने वेगळे केले.जेल कूमासी ब्रिलियंट ब्लू सोल्यूशन (40% मिथेनॉल, 10% एसिटिक ऍसिड, 0.05% कूमासी ब्रिलियंट ब्लू R-250) सह निश्चित आणि डागलेले आहे, रंगीत आहे आणि फॉस्फोरेसंट इमेजिंग स्क्रीनवर 20 तासांसाठी (NMPy वरून nsp12 शोधण्यासाठी) किंवा (जास्तीत जास्त) 2 तास (nsp9 NMPylation चे मूल्यांकन करण्यासाठी).स्क्रीन स्कॅन करण्यासाठी टायफून 9200 इमेजर (जीई हेल्थकेअर) वापरला गेला आणि सिग्नल तीव्रतेचे विश्लेषण करण्यासाठी इमेजजे वापरला गेला.
MS विश्लेषणासाठी, 1 µM nsp12-His6 आणि 10 µM nsp9 (हेक्साहिस्टिडाइन टॅगशिवाय) NMPylation विश्लेषण (SI परिशिष्ट, टेबल S1) मध्ये वापरले गेले आणि 500 µM UTP आणि GTP ची वाढलेली एकाग्रता वापरली गेली.त्यांच्या एकाग्रता आणि अपेक्षित प्रथिने गुणवत्तेवर अवलंबून, मासप्रेप स्तंभ (वॉटर) सह सुसज्ज वॉटर्स ACQUITY H-Class HPLC प्रणाली 1 ते 10 µL बफर केलेले प्रोटीन सोल्यूशन ऑनलाइन डिसॉल्ट करण्यासाठी वापरली गेली.बफर A (पाणी/0.05% फॉर्मिक ऍसिड) आणि बफर B (एसीटोनिट्रिल/0.045% फॉर्मिक ऍसिड) च्या खालील ग्रेडियंटद्वारे सिनॅप्ट G2Si मास स्पेक्ट्रोमीटर (वॉटर) च्या इलेक्ट्रोस्प्रे आयन स्त्रोतामध्ये डिसल्ट केलेले प्रथिने उत्सर्जित केले जातात आणि स्तंभाचे तापमान असते. 60 ° C आणि प्रवाह दर 0.1 mL/min: 2 मिनिटांसाठी 5% A सह इल्युशन आयोक्रेटिकली, नंतर 8 मिनिटांत 95% B पर्यंत रेखीय ग्रेडियंट, आणि आणखी 4 मिनिटांसाठी 95% B राखून ठेवा.
500 ते 5000 m/z च्या वस्तुमान श्रेणीसह सकारात्मक आयन शोधले जातात.ग्लू-फायब्रिनोपेप्टाइड बी स्वयंचलित मास ड्रिफ्ट सुधारण्यासाठी दर 45 सेकंदांनी मोजले जाते.बेसलाइन आणि स्मूथिंग वजा केल्यानंतर सरासरी स्पेक्ट्रम डीकॉन्व्हॉल करण्यासाठी MaxEnt1 विस्तारासह MassLynx इन्स्ट्रुमेंट सॉफ्टवेअर वापरा.
UMPylated HCoV-229E nsp9 हे सिक्वेन्सिंग-ग्रेड मॉडिफाइड ट्रिप्सिन (सर्वा) जोडून पचवले गेले आणि 37 °C वर रात्रभर उष्मायन केले गेले.एक Chromabond C18WP स्पिन कॉलम (भाग क्रमांक 730522; मॅचेरी-नागेल) पेप्टाइड्स काढून टाकण्यासाठी आणि केंद्रित करण्यासाठी वापरला गेला.शेवटी, पेप्टाइड 25 μL पाण्यात विरघळले, ज्यामध्ये 5% एसीटोनिट्रिल आणि 0.1% फॉर्मिक ऍसिड होते.
MS द्वारे ऑर्बिट्रॅप वेलोस प्रो मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो सायंटिफिक) वापरून नमुन्यांचे विश्लेषण केले गेले.अंतिम nanoâ HPLC प्रणाली (Dionex), सानुकूल एंड-माउंट 50 सेमीने सुसज्ज आहे?2.4 μm चुंबकीय मण्यांनी पॅक केलेला 75 μm C18 RP स्तंभ (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Proxeon nanospray स्रोताद्वारे ऑनलाइन मास स्पेक्ट्रोमीटरशी कनेक्ट करा;300 µm आतील व्यास ×??1 सेमी C18 PepMap पूर्व एकाग्रता स्तंभ (थर्मो सायंटिफिक).सॉल्व्हेंट म्हणून पाणी/0.05% फॉर्मिक ऍसिड वापरून, नमुना आपोआप अडकला आणि 6 μL/मिनिट प्रवाह दराने डिसेलिनेटेड झाला.
खालील ग्रेडियंट्सचे पाणी/0.05% फॉर्मिक ऍसिड (विद्रावक A) आणि 80% acetonitrile/0.045% फॉर्मिक ऍसिड (विद्रावक B) 300 nL/मिनिट प्रवाह दराने ट्रायप्टिक पेप्टाइड्सचे पृथक्करण साध्य करण्यासाठी वापरले गेले: 4% B साठी 5 मिनिटे, नंतर 30 A रेखीय ग्रेडियंट मिनिटांत 45% B पर्यंत आणि 5 मिनिटांत 95% द्रावक B पर्यंत रेखीय वाढ.क्रोमॅटोग्राफिक स्तंभाला स्टेनलेस स्टीलच्या नॅनो-एमिटर (प्रॉक्सियन) शी कनेक्ट करा आणि 2,300 V क्षमतेचा वापर करून मास स्पेक्ट्रोमीटरच्या तापलेल्या केशिकावर एल्युएंटची थेट फवारणी करा. ऑर्बिट्रॅप मास अॅनालायझरमध्ये 60,000 च्या रिझोल्यूशनसह सर्वेक्षण स्कॅन संबंधित आहे. किमान तीन डेटा MS/MS स्कॅनसह, 30 सेकंदांसाठी डायनॅमिकरित्या वगळलेले, रेखीय आयन ट्रॅप टक्कर प्रेरित पृथक्करण किंवा उच्च ऊर्जा टक्कर पृथक्करण वापरून ऑर्बिट्रॅप डिटेक्शनसह एकत्रित केले जाते, रिझोल्यूशन 7,500 आहे.
पोस्ट वेळ: ऑगस्ट-03-2021